干貨丨熒光與熒光顯微鏡知識點梳理

1. 熒光

當某種物質受到波長較短的光波照射時,會發射出波長較長的光。若切斷照射光后仍能發光,稱之為磷光；若照射停止后光立即熄滅,這種光稱之為熒光。熒光發光機理可按量子理論通俗解釋: 光具有波動、粒子二重性,光波愈短,其光子能量愈強；反之波長愈長其能量則弱。當某些物質受到紫外線或較短波長光照射,吸收了全部或部分光能量,使其分子的能級升高而處于亞穩定狀態,當恢復到穩定的基態時,這些分子就會立即釋放多余的能量,其中一部分化為熱量而消失。但對某些物質而言,向基態躍遷時是以“光”形式釋放,因為有部分能量被消耗,所以重新發出的光能量總比吸收的能量要小。由于能量愈小,光波愈長,所以物質所激發的熒光總比照射它的光波要長。

磷光的能量較熒光還要小,所以它的波長比熒光要長,壽命可達數小時之久,這就是兩者的區別。

激發物質發出熒光的照射光稱之為激發光,也是該物質吸收光,它的光譜包含紫外線、藍光,現已擴展到黃綠光波段。

熒光光譜色隨物質的差別和所用熒光色素的不同也有區別。它的光譜與可見光一樣,紅、橙、黃、綠、青、藍、紫全有,有的物質標本只有一種顏色熒光,但有的有多種顏色熒光。

熒光可分為自然熒光和人工熒光兩種：

自然熒光(或稱一次熒光、自發熒光、自體熒光和原發熒光): 某些物質勿需經過處理,當受到激發光照射就能產生熒光的稱為自然熒光。如植物的葉子、莖；動物的一些組織:牙齒、骨質、爪甲、白頭發、尿液、血漿及維生素等；某些結晶體、有機化合物、合成物、油類、蛋白質、臘等。所以自然熒光在造紙、纖維、染料、化學藥品、食品和油脂等工業方面被用作檢查和鑒別。在環保中對大氣污染公害的監測中也用紫外線進行粉塵熒光觀測。

熒光顯微鏡初期就用于觀察動、植物標本的自然熒光。

人工熒光(或稱二次熒光、繼發熒光、染色熒光): 某些物質必須經過化學處理,如用染料——熒光色素與其結合,才能在激發光下發射熒光。所謂熒光色素是一類能產生明顯熒光,并能作為染料使用的有機化合物,它有天然和人工合成兩類,后者常用的有數十種之多,如吖啶橙、羅達明等。熒光色素也叫作熒光染料,這樣非熒光試樣通過有選擇的熒光色素進行染色后,在熒光顯微鏡下就可從顏色和反差中清晰地分辨其中不同的細胞組織。染色熒光方法在細胞化學和組織化學中很早就應用了,如用鹽基黃(Auramine)對結核菌染色是常見的。

免疫熒光是利用抗原抗體能進行特異性結合的免疫化學特性,以熒光色素標記已知的抗體(或抗原)作為試劑,在特定條件下檢測未知的抗原(或抗體)。借助于熒光顯微鏡觀察抗原抗體結合物的熒光現象,從而可對抗原抗體物質進行定性、定位觀察。此技術已被廣泛應用于醫學和生物學多種領域之中,并在標準化、定量化、自動化三方面達到較先進水平。免疫熒光也稱為熒光抗體法,它在1950年由美國生物學家D.Coo ns試驗成功,并獲得諾貝爾獎。幾十年來在細菌學、病毒學、免疫學、免疫病理學、寄生蟲學、腫瘤學方面得到應用。熒光在農業科學、生物學、古生物學、獸醫學等方面也獲得廣泛應用。

2. 熒光的特性

歸納起來,熒光具有以下特性：

(1)物質欲發射熒光,必須吸收激發光能。在常溫下所發出的熒光波長較激發光長,能量較激發光弱(Stokes定律)。

(2)熒光的吸收光譜和發射光譜大致對稱于某軸分布,形成鏡象關系,它的吸收光波段A和發射光波段B大約在150nm范圍內,之間的峰值距C則隨物質而異,最大相距約為180nm,小的約為30nm ,但大多數激發光譜長波部分常常與發射光譜短波部分重疊在一起。

FITC的吸收和發射光譜曲線

物質熒光的光譜特性是固有的,當它接收特定的激發光(吸收),就會發出固有熒光色,因此依據熒光的特異性可判斷是什么物質。

(3)熒光發出時不象普通光那樣會產生熱效應,它是冷光。熒光隨激發光停止照射時,在10^-7 s～10^-8 s間內消失。

(4)熒光發光方向與激發光的方向無關,它呈球體輻射。

(5)熒光的衰減與猝滅。熒光的衰減是指在受激發光照射期間,發出的熒光光強的減弱。衰減的程度取決于激發光強度和照射時間。采用高強度激發光時其衰減要顯著得多,有時在1秒的間隔內,熒光就會大大減弱。熒光還有猝滅現象,特別對于繼發熒光,這是一種復雜的現象,由于處于激發狀態的熒光發色團分子發生了變態,導致熒光量子產量的減少,這樣便縮短了熒光的發射。

(6)熒光的光強I熒一般是較弱的,熒光效率約在0.1～ 0.9之間,通常只在0.3～0.4。它由下式決定

I熒 = R × Z
R——吸收光強,它僅占光源能量的一小部分；Z——小于1的系數。

(7)熒光具有偏振性

表1列舉了常用的熒光色素的平均吸收波長、熒光平均波長和峰值間隔。表中數值可用顯微光度計或分光光度計和熒光光度計在熒光色素染色標本上測定。

測定物質的吸收光譜和熒光光譜是非常重要的,特別對于新的色素必須測定。所測數據以文件形式記錄,可作為設計熒光顯微鏡的基本依據。

3. 熒光顯微鏡

熒光顯微鏡是熒光顯微檢測的專用工具,它是光學顯微鏡的一種。它除了具有光學顯微鏡的基本結構和光學放大作用外,基于熒光的特性,還具備以下獨特的功能要求:

(1)提供足夠能量的能激發出熒光的光源。

(2)有著適應不同物質所需的激發光譜一組濾色片,從光源中選擇合適的激發光譜,使析出的光譜與該物質的吸收光譜重合,以期望獲得最大的熒光。

(3)為獲得較弱的熒光圖像,還要建立一套截止濾色片,它使所需觀察的熒光進入系統成像,而將其余的光波,包括發射光阻擋在外,用來提高圖像的襯度。

(4)放大的光學系統應適應熒光的特性,最終獲得既能觀察又能攝影的高亮度、高分辨力的良好襯度的熒光圖像。

(5)儀器的安全性。應用汞燈要防止紫外線的泄漏和汞燈的爆炸,保證電器安全。

4. 光源

熒光顯微鏡光源的選擇取決于所需檢測的熒光物質的吸收光譜,從表1中可見,熒光色素的平均吸收波長峰值從紫外(340nm)到黃綠光(595nm)。具有這些光譜的強光源有超高壓汞燈、超高壓氙燈和大功率的鹵素燈。超高壓汞燈是熒光顯微術中最常用的光源,它是利用金屬汞蒸汽在超高壓下放電發光原理制成的。光度極強,可達2×10⁸ cd/m²～3×10⁸ cd/m³,發光光譜為280nm～600nm,具有不連續的線條光譜特性,有的波段特別明亮。下圖是HBO—200W光譜能量分布,在紫外（UV)區有296.6nm、302.3nm、312.5nm、313.2nm、 334nm和365nm等波峰,其中365nm是最強的峰值,也是應用最廣的紫外激發光。其次在藍光區(B)有404.7nm和407.8nm及434.8nm～435.3nm峰值,綠光(G)區中有546.1nm和黃光區(Y)577nm,它用于激發羅達明B200的光源。

HBO—200W發射光譜曲線

超高壓汞燈(HBO)發光時,泡內產生50～70個標準大氣壓,它的引燃電壓很高,工作時維持電壓較低,約為50V～60V,電絲電流在4A左右,燈的壽命與啟動次數和工作時間有關。啟動次數愈多,每次工作時間愈短,壽命愈短。生產廠在出廠時應給出規定平均壽命,如德國萊茨公司規定每啟動一次工作3h,共啟動70次為準,平均壽命為200h；日本奧林巴斯公司平均壽命是400h。使用中,當燈泡變黑或達規定時間應調換燈泡 ,否則除了燈的光度下降外,而且還有可能出現爆炸事故。熄滅時一般約15分鐘方完全冷卻,在未完全冷卻時,切勿打開燈室,因熱燈泡內壓力很大,聚冷會引發爆炸。因此在說明書上應予強調并要求統計使用時間 ,填寫記錄,注意安全。

超高壓氙燈(XBO)是利用惰性氣體在超高壓(30個標準大氣壓)下放電發光原理制成的。它的發光光譜與太陽光譜相近,是連續光譜,波峰在400nm～450nm之間,光譜較平緩,而且有豐富的連續紫外線,是良好的紫外和藍光激發光源,它的光度也極強,如XBO—75W的光度在1.5×10⁸ cd/m²～4×10⁸ cd/m²之間,它的色溫在 6000°K以上,是日光的色溫,所以是彩色攝影極好的照明光源。其優點是操作方便,啟動立即點燃,點燃后即使立即熄滅,也不會損壞燈泡,壽命很長。發光過程中,弧光穩定,色溫不變,其缺點是需專用的低壓直流電源箱,燈的溫度極高,價格比汞燈更為昂貴。

鹵素燈是在石英燈殼內充入鹵族元素溴或磺,充溴的叫溴鎢燈,能發出強烈的連續可見光譜,它的體積小,重量輕,價格最便宜,適用不需要紫外線激發的熒光顯微鏡中作激發光源。如醫院中用FITC(異硫氰酸熒光黃)進行常規診斷時,需要藍光490nm波段激發時,用12V 100W鹵素燈就很合適。

光源選擇其次要考慮它的功率,選用大功率還是低瓦數的燈泡? 原則上講應盡可能選用低瓦數的光源,無疑這對結構設計和成本是有利的。但過低的瓦數在激發時不能激發出熒光或發出熒光不穩定,就不能使用 了。而能否激發出熒光又與整個成像系統的光能利用相關,能充分合理有效地利用光能,瓦數就可以降下來,單純地追求大功率光源作為熒光檢測并不可取,還會引發熒光的衰減和猝滅。當前供應的落射熒光顯微鏡僅配備100W的汞燈或氙燈和鹵素燈。

在選擇光源時,還需注意到弧光尺寸,即光源發光區的大小。如汞燈50W 弧光尺寸為1.0×0.3mm,200W為2.2×0.5mm,而100W為0.25×0.25mm。能否正好充滿系統的入瞳使光能充分利用,對一個優良的熒光顯微鏡,各種倍率的物鏡“光能”皆可充分有效的利用是一個值得關注的指標。

在熒光顯微鏡設計中,光源選擇在總體設計中是至關重要的,它決定了儀器的使用范圍和成本,也反映了儀器的檔次。實驗室以上的顯微鏡應以汞燈為主光源,簡易型(專用)的顯微鏡則以鹵素燈為主光源。

5. 濾色片

濾色片是熒光顯微鏡的關鍵部件,在熒光顯微鏡中按其功能可分為激發濾色片和截止濾色片兩類。激發濾色片的功能是從光源中分析出所需的特定光譜,以激發標本產生熒光。截止濾色片的功能是僅把標本上發出的熒光透過成像,而將其它光阻擋不參與成像,一般激發濾色片安置在緊靠光源,而截止濾色片在物鏡與目鏡之間，按其透過光譜特性曲線可分為“短波通過”、“長波通過”和“波段通過”濾色片。波段通過濾色片按波帶寬度又可分為“寬波帶”和“窄波帶”濾色片,如果半寬帶(即HW=50%的透射峰的主透射帶的寬度之半)大于50nm,視為“寬波帶型”；若小于20nm,則可視為“窄波帶型”。

濾色片初期用貯放玻璃盒中的有色液體,后改用帶色膠質片,由于易變色和使用不方便已被淘汰。現在經常使用的為色玻璃和干涉濾色片,色玻璃大都屬寬波帶濾色片,透過波段寬,透過率隨厚度而降低,價格相對低廉。由于色玻璃與空氣的界面上,約有4%光線被反射掉,玻片愈多,光能損失愈大,限制了它的使用性能。干涉濾色片的出現,可按需要制成能透過或截止一定波段的濾色片,從而促使熒光顯微術的進展,現代技術上已能對某波段的透射率或反射率進行控制。

從表1可見,多數熒光色素和熒光發色團分子具有相當寬的吸收光波帶和熒光波帶,峰值間隔又較大,所以需要得到強熒光時,很少使用窄波帶濾色片,因為它致使相當大的光源能量損失了(沒有利用),僅在光源的強發射譜線和激發時的吸收峰相重合時才使用。當使用寬波帶濾色片時,往往組織成分和光路中的自發熒光會被這類濾色片中的短波光激發出來,加到熒光圖象中而混擾。多數應用中,激發濾色片的半寬約20nm就能給出滿意的結果。

用濾色片(色玻璃和干涉濾色片)選取光源中的部分光譜段以獲得熒光物質的激發光以及發揮相應的截止作用從原理上講是完全可以的,但不可能配備那么多濾色片去適應所有的熒光物質的需要。如何建立最小的濾色片系列,組合后使之滿足各種不同的要求,這是設計者必須要認真權衡的問題。除了功能考慮外,還要注意成本和濾色片壽命。色玻璃和干涉濾色片價位比,目前相差百倍,一些軟膜干涉濾色片的壽命僅兩年有效。因此設計者必須關注“用戶”需要,經常使用那些熒光色素,對于特殊要求的可作為選用件特殊處理。

對于激發濾色片一般按激發光譜分為: 紫外區(UV)波段在340nm～380nm,小于400nm；紫/藍區(V)波段在390nm～460nm；藍光區(B)波段在460nm～500nm；綠光區(G)波段在500nm～570nm,目前還有黃光區(Y)波段在570nm～595nm之間,各廠家在各激發區內還進行細分。細分的原則是按不同的激發波帶寬度和峰值,如在B激發中分為400nm～490nm；420nm～490nm；450nm～490nm；465nm～495nm和470nm～490nm 5種。

6. 光學成像系統

熒光顯微鏡的光學系統必須完成兩個主要功能:

(1)要有效地激發試樣中熒光反應物,使用的發射波長最好接近它的吸收峰；

(2)必須盡可能多地收集發出的熒光,以便使顯微鏡內可見度最合適。

熒光光學系統的成像質量主要取決于像的襯度和像的亮度,像的襯度是由樣品中激發出的熒光與背景上觀察到的光之比決定的。背景光包括透過截止激發光的濾色片的雜散激發光,樣品組織成分的自發熒光和光學系統的自發熒光和雜散光,在熒光顯微術中盡全力要解決的是既獲得最佳的像襯度,同時又維持像有足夠亮度,這兩者往往是矛盾的。例如用極窄波帶濾色片激發時僅利用了極少的光能,背景暗了但熒光亮度也弱了。在應用時,只能兼顧,合理的權衡以決定取舍。

熒光顯微光學系統需要優先考慮的是:

(1)光學系統組成的材料應選用在激發光波內無熒光材料,不但指光學系統玻璃也包括膠合制造中的膠合劑、切片、蓋玻片和浸液以及密封劑。若有自發熒光,不但會增加背景光,有時還會混淆觀察熒光圖像。

(2)光學系統的參數選擇中,應將獲得最大光能作為第一考慮因素。

照明系統中集光鏡應選用最大的包容角；采用柯勒照明并使燈絲或弧光像充滿入瞳,以期望獲得高效率的均勻照明。

收集熒光成像的物鏡,因為像面照度與數值孔徑 NA²成正式,為此作為熒光用物鏡應有較大的NA值。目前10×已達0.5；20×達0.75；40×達0.9；油鏡40×達1.3。

雙目鏡筒作為熒光用時應在可見光譜段有較高的透過率,采用鍍膜技術可大大地減少光能的損失,它可比一般雙目鏡筒透射率提高一倍,這對弱熒光物質觀察是必須的。

(3)作為熒光光學系統各組成部件的光譜特性也是至關重要的,特別是紫外光要通過的部件,如照明系統,聚光鏡以及物鏡,要關注紫光區的透射系數。聚光鏡要選用透紫外線的材料。照明系統中反光鏡表面鍍鋁比鍍銀好,因為鋁在UV和V區反射率在90%以上,而銀僅達70%。加拿大膠吸收紫外線,在紫外區通過處不宜用作膠合劑。

本文轉載自作者楊廣烈，材料牛石小梅編輯整理。

參考文獻

[1] 楊廣烈. 熒光與熒光顯微鏡[J]. 光學儀器,2001,(02):18-29.

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