激光共聚焦顯微鏡要點解析

激光共聚焦顯微鏡是80年代發展起來的一項劃時代意義的高科技新產品，它是在熒光顯微鏡成像基礎上加裝了激光掃描裝置，利用計算機進行圖象處理，使用紫外或可見光激發熒光探針，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖象，在亞細胞水平上觀察例如Ca2⁺，pH值，膜電位等生理信號及細胞形態的變化，成為形態學，分子細胞生物學，神經科學，藥理學，遺傳學等領域中新一代強有力的研究工具。

一、基本原理和功能

1. 1　基本原理

傳統的光學顯微鏡使用的是場光源,標本上每一點的圖象都會受到鄰近點的衍射光或散射光的干擾; 激光共聚焦顯微鏡利用激光束經照明針孔形成點光源對標本內焦平面上的每一點掃描,標本上的被照射點,在探測針孔處成像,由探測針孔后的光電倍增管( PM T)或冷電耦器件( cCCD)逐點或逐線接收,迅速在計算機監視器屏幕上形成熒光圖象。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的,焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發射針孔,焦平面以外的點不會在探測針孔處成像,
這樣得到的共聚焦圖象是標本的光學橫斷面,克服了普通顯微鏡圖象模糊的缺點。

1. 2　激光共聚焦顯微成像儀的圖像處理功能

1）“細胞CT”功能

通過狹縫掃描技術將我們對細胞的研究由多層迭加影像推進到真正的平面影像水平,使圖像更加清晰,從而為分子細胞生物學的深入研究拓寬了視野。

2）三維成像與細胞內部結構圖像相結合的功能

激光共聚焦顯微成像儀可以將斷層圖像與三維重建圖像有機的結合起來,不但能揭示細胞內部的結構和提供細胞的長、寬、厚、斷層面積、細胞體積等參數,而且可以給人以三維立體的概念。例如: 可以使細胞旋轉起來從而能隨意觀察細胞各個側面的表面結構。

3）將形態學、生理學與分子細胞生物學的研究相互結合

利用激光共聚集顯微成像儀不但可以觀察細胞形態的動態變化,而且用適當的熒光探針可以觀察細胞內部的生物化學變
化。如細胞內游離Ca²⁺、pH值及其它細胞內離子的實時測定。熒光原位雜交的雜交點觀測和定量分析。

1. 3　激光共聚焦顯微成像儀的細胞生物學功能

1）粘附細胞分選技術

Ul tima 型激光共聚焦顯微成像儀是目前世界上唯一能對粘附細胞進行分選的儀器,而這種不改變細胞周圍培養環境,細胞鋪展程度和生長狀態的分選方式是至關重要的。

2）細胞激光顯微外科及光陷井技術

該儀器可將激光當作一把“光刀子”使用,完成諸如細胞膜瞬間穿孔,染色體切割,神經元突起切除等一系列細胞外科手術,也可以作光陷井操作。

3）熒光光漂白恢復技術

該技術用來測定活細胞的動力學系數。通過對活細胞的動力學系數的測定,可對細胞骨架構成、核膜結構、大分子組裝和徑跨膜大分子遷移率等領域進一步研究。

二、應用

2. 1　細胞內游離鈣測定

2. 1. 1　細胞的獲取　

細胞內游離鈣的測定需要活的生長旺盛的細胞。其來源可從細胞株培養獲得,也可由動物活體直接取得。培養優良的細胞,是一件非常辛苦又花費精力的工作,但它可以確保每次都有足夠多的細胞供實驗使用;從動物的活體上直接取細胞,需要實驗人員高超的手術技巧,能準確地摘取標本,并且盡量避免細胞的丟失和死亡。

2. 1. 2　細胞的染色　

根據各種細胞的特性和活性,確保每次染色成功,是技術性很強的實驗技術,需要一段摸索的時間。首先確定加多大濃度的鈣敏熒光染料FLUO-3/AM,在CO₂培養箱中孵育多長時間, 是否需要加去污劑F-127助溶?這些在幾次試驗以后才能夠確定。

2. 1. 3　細胞的粘附　

如果培養的是粘附細胞,那么它們會較為牢固地粘附在培養皿上或載玻片上,可是懸浮的細胞如血小板,紅細胞很難貼壁。為了解決這個問題必須對載玻片進行處理。處理主要方法為使用多聚賴氨酸,蛋清,聚乙烯醇等作粘貼劑。

2. 2　細胞通訊

2. 2. 1　確定原細胞通訊情況　并非所有的細胞都有這種縫隙連接的通訊,例如: 淋巴細胞,部分癌細胞就沒有這種通訊,因此,必須預先對原細胞作用出判斷。

2. 2. 2　細胞通訊測定結果的統計學處理　

由于細胞處于不同的生長期,即使同一細胞系,其恢復速率也不完全一致。這就必須取得盡可能多的標本數據來進行統計。

2. 2. 3　觀察細胞的選擇　

在一個視野里有若干個細胞。作為數據采集對象必須選擇3 組細胞為觀察目標: ( 1)對照組: 選孤立的單個細胞1～ 2 個,由于此類細胞與其它細胞不相連接,因而就不會有細胞通訊的機能,適合用作對照;( 2)觀察組: 選相互緊密相連的細胞5～ 6 個,這種細胞間存在通訊,可作為測試對象; ( 3)校正組: 選相互緊密相連的細胞1～ 2個,不用激光去淬滅,用于作空白校正,這是因為細胞在激光照射下,其熒光強度會產生自然漂白,為消除這種因素影響,必須對背景進行校正。

三、激光共聚焦顯微鏡與光學顯微鏡之比較

光學顯微鏡的基本結構主要由機械部分、照明部分和光學部分(反光鏡、聚光鏡、光圈、目鏡、物鏡等)組成。激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)則是在20 世紀80 年代推出的高科技產品,其基本結構比光學顯微鏡要復雜, 它除了包括光學顯微鏡部分之外, 主要由激光光源、掃描裝置、檢測器、計算機系統(包括數據采集, 處理, 轉換、應用軟件)、圖象輸出設備、光學裝置和共聚焦系統(如光學濾片, 分光器, 共聚焦針孔及相應的控制系統)等部分組成。由此可見, 兩種顯微鏡在構造上最大的區別就在于LSCM 具有結構復雜的計算機系統、激光系統、掃描裝置和共聚焦系統。

在光源方面, 由于兩者性質的不同, 所成像的清晰度也有明顯的區別。光學顯微鏡的光源大致可分為兩類, 一是自然光, 一是內置燈源。可見光經反光鏡、聚光鏡的作用, 對全視野進行照明, 即場光源, 也就是說它只能對標本局部厚度作平面成像, 這樣不僅要求標本為薄切片(5 ～ 10μm), 而且標本上任何一點的圖像都會受到鄰近點的衍射光和散色光的影響, 降低了圖像的反差和分辨率。LSCM 采用單色激光作為光源, 并用附設的小孔光闌-針孔(pinhole)使光源成為點光源, 與光學顯微鏡的場光源相比, 共聚焦顯微鏡的點光源具有光源方向性強、發散小、亮度高、高度的空間和時間相干性以及平面偏振激發等獨特的優點。LSCM 除了在照明光源前有一個針孔(pinhole)外, 在檢測器前方也有一個針孔, 光源針孔和檢測針孔的位置相對于物鏡焦平面是共軛的,也就是光點通過一系列的透鏡最終可同時聚焦于光源針孔和檢測針孔, 也就是所謂的“共聚焦” 。光源以激光掃描束的形式形成點光源對樣品進行逐點掃描, 通過掃描移動裝置使得樣品光源照射點始終位于焦平面處, 也就是使樣品中不同的掃描點始終在物鏡和會聚透鏡的光軸上, 其產生的光信號由檢測針孔后的光電倍增管逐點接收后, 轉變為電信號傳輸至計算機, 在屏幕上呈現為清晰的整幅焦平面的圖象。點光源可通過對樣品進行左右、上下的掃描來獲得厚標本(可達400μm)不同層面的圖像, 亦即可對細胞或組織厚片進行類似CT 斷層掃描的無損傷性連續光學切片(optical sectioning), 連續光學切片經計算機三維重建的處理, 能夠從任意角度觀察標本的三維剖面或整體結構。而傳統的光學顯微鏡即使通過石蠟連續切片等繁瑣的步驟也難達到LSCM 在三維重建方面的效果。

光學顯微鏡的分辨率可用物鏡的分辨率來表示,此外, 光學顯微鏡不僅從焦平面上收集光量, 而且還收集來自焦平面上、下的光量, 使分辨率大大降低。與光學顯微鏡相比, LSCM 的分辨率除了與光的波長有關外, 主要取決于針孔的直徑與物鏡的數值孔徑。

參考文獻：

[1] 李楠, 王黎明, 楊軍. 激光共聚焦顯微鏡的原理和應用[J]. 軍醫進修學院學報, 1996, 17(3): 1-3

[2] 霍霞. 激光共聚焦顯微鏡與光學顯微鏡之比較[J]. 激光生物學報, 2001, 10(1): 1-3

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