流式細胞儀要點梳理

流式細胞術是一種對快速直線流動狀態中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數、快速的定性、定量分析或分選的技術，具有檢測速度快、測量參數多、采集數據量大、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點，已經成為近代科學研究中的熱門專題，研究它的論文數量也在逐年上升（見圖1）。流式細胞儀（flow cytometer，FCM）是以流式細胞術為核心技術，集光學、電子學、流體力學、細胞化學、生物學、免疫學以及激光和計算機等多門學科和技術于一體的先進科學技術設備。它被廣泛應用于臨床醫學、細胞學、生物學、微生物學、制藥學、生殖學等領域，是現代科學研究中的先進儀器之一，被譽為實驗室的"CT"。

圖1 在PubMed 中用關鍵詞" 流式細胞術" 搜索的文獻數

1 流式細胞儀的工作原理

圖2為流式細胞儀基本結構。它主要有四部分組成：流動室和液流系統；光源與光學系統、信號收集與信號轉換系統、計算機與分析系統。具有分選功能的流式細胞儀還包括分選系統。將待測細胞熒光染色后制成單細胞懸液，在鞘液的包被下單行排列，依次通過流動室檢測區域。以激光作為激發光源，垂直照射檢測區域的樣品流，被熒光染色的細胞在其照射下，產生散射光和激發熒光，它們同時被前向光電二極管和側向90°方向的光電倍增管接收。前向小角度的光散射信號（forward scatter,FSC）反映了細胞體積的大小；側向90°方向的光散射信號（side scatter，SSC）反映了細胞內顆粒的復雜情況。激發熒光信號代表了所標記的被測細胞內部顆粒的信息。這些光信號轉化成電信號，被傳送到計算機，經A/D 轉換器傳輸到微機處理器形成數據文件，保存到計算機上，以備脫機后的數據處理和分析。細胞的分選是將待測液滴充以正負不同的電荷，讓其在高壓電場的作用下偏轉，落入不同的收集容器中，從而實現細胞的分離。

圖2 流式細胞儀結構示意圖

2 流式細胞儀的應用

2.1 在臨床上的應用

細胞癌變過程中伴隨細胞DNA 含量的改變，DNA 非整倍體細胞是惡性腫瘤的特異性標志。流式細胞儀的FSC 能夠給出這些信息，在腫瘤的早期診斷和鑒別診斷中有著很重要的作用；早在80 年代人們發現特定T 細胞亞群可以反映AIDS 患者的臨床狀態，而流式細胞儀可以對這些T 細胞亞群進行檢測，為AIDS 的診斷、治療提供有用信息；流式細胞儀借助于各種熒光染料測定一個細胞的多種參數完成白血病及淋巴瘤的診斷，準確率達90%左右，較傳統形態學檢查準確性提高10%-20%；流式細胞儀對淋巴細胞及其亞群數量的檢測，可以探索疾病的發病機理、病程、預后，指導臨床治療方案。

2.2 在生物學及微生物學上的應用

從早期到現在，在細胞及細胞器方面很多已被人們所接受的科技，都經流式細胞儀研究過。在細胞功能的早期研究中，研究者僅能通過觀測微生物的吞噬來研究噬中性粒子,而流式細胞儀可以通過它們的大小、形狀、抗體及吞噬過程中微生物種類、數量的變化更深入的辨別、研究這些噬中性粒子；氧自由基的實時、單細胞繁殖評價，DNA 倍體分析，細胞循環中細胞增殖和凋亡分析等都會用到流式細胞儀；流式細胞儀對細胞周期可以輕松分析，促進了以此為基礎的植物學的發展，輔以成像儀器，流式細胞儀可以對微生物的成長、繁殖進行3-D 研究。

2.3 在生殖學及制藥學上的應用

利用對精子DNA 進行無害標定的DNA 染料(如Hoechst 33342)或H-Y 抗體都可以對精子進行檢測和分類，完成生殖學
上的要求；FCM 檢測腫瘤細胞的耐藥相關蛋白的表達水平，對檢測臨床腫瘤化療效果及藥物的選擇有一定的意義。此外，流式細胞儀在細胞毒，可溶性蛋白質分子，鈣離子濃度檢測等都有很廣泛的用途。此外，流式細胞儀在細胞毒，可溶性蛋白質分子，鈣離子濃度檢測等都有很廣泛的用途。

3 流式細胞儀的最新進展

1）儀器功能專業化

Partec CyFlow、BD FACSCount 可以實現CD4,CD8,CD3 絕對計數，用于HIV 檢測的經濟普及型流式細胞儀。CytoBuoy 公司生產多種用于水體微型生物分析的流式細胞儀，如CytoBuoy 可安放在浮標上;CytoSub 可在水下200 米使用，具有特殊的耐壓裝置，以及內部鞘液循環處理裝置，不需外部加入鞘液；CytoSense GV 裝有特殊的壓力模塊，可除去藍細菌的空胞。Bentley Instruments 公司、Delta Instruments公司和FOSS Electric 公司專門設計提供奶牛場使用的專項檢測儀，BioDETECT 公司的Yeastcyte 則是專用于酵母計數與活性分析。Union Biometrica 公司的COPAS 能夠分選果蠅、蚊子、斑馬魚等的卵和幼蟲。

2）儀器全面自動化

免疫標本制備儀、組織樣本制備儀和樣品前處理儀在實驗中得到廣泛應用。不同規格的多孔板或多試管自動進樣器加速了自動化進程。Epics XL、FACSCalibur 等主流廠家儀器都實現了自動化。

3）多色多參數分析迅速發展，分析、分類速度加快

新興熒光探針的不斷開發和儀器軟、硬件的逐步更新，流式細胞儀的多色熒光分析得到了迅速發展，對細胞亞群的識別更準確、更精細。一種激光（如488nm 激光）同時激發多種熒光材料，目前已出現488nm 單激光激發5 色到7 色的儀器，如BD FACSAria和LSRII, Beckman Coulter FC500 和CyAn ADP 等；多種激光激發多種熒光染料，如Partec CyFlow ML 采用5 種激光激發13 色熒光實現16 個參數的分析。隨著細胞分選系統的發展，流式細胞儀的分析、分選速度明顯加快，如BD FACSAria獲取速度達70000 個細胞/s，分選速度50000 個細胞/s，四路分選；Beckman Coulter MoFlo XDP 分析速度100000 個細胞/s，分選速度70000 個細胞/s，四通道分選。

4）儀器小型化

適應實際需要的小型化、便攜式流式細胞儀也是一個發展的趨勢。最近幾年，微流體流式細胞儀成為研究的熱門方向，在這方面的研究也越來越多，取得了一定的科研成果。耿鑫等對微流體數字化噴點技術進行了研究，使之能夠用于小型實驗室。廖錫昌等研制了熒光微芯片分析檢測器，基本實現了它的微型化。Shao Guocheng 等研發了帶有非共面顯微透鏡和3-D 流體聚焦單元的微流控芯片，實現了流體聚焦單元的真正三維化。David Barat 等研究集成光學系統代替傳統的自由空間光學系統，提出四種不同的方法，找出最佳設計方案。Segyeong Joo 等發明規格15cm×10cm×10cm、重量為800g 的微流體流式細胞儀，它能同時給出熒光信息和阻抗信息，使細胞分類更快、更容易。Md. Z. Islam 等發明用來分離干細胞的光纖耦合微流體流式細胞儀。Joel P. Golden 等發明多波長微型流式細胞儀，它可以具有532nm、635nm 波長激發，665nm、700nm 熒光探測和散射光探測的功能。

參考文獻：

[1] 趙書濤, 武曉東. 流式細胞儀的原理、應用及最新進展[J]. 現代生物醫學進展, 2011, 1(22): 1-3

材料人編輯部Allen編輯整理。

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