流式細胞儀的原理、應用及最新進展

前言

流式細胞術是一種對快速直線流動狀態中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數、快速的定性、定量分析或分選的技術，具有檢測速度快、測量參數多、采集數據量大、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點，已經成為近代科學研究中的熱門專題，研究它的論文數量也在逐年上升。流式細胞儀（flow cytometer，FCM）是以流式細胞術為核心技術，集光學、電子學、流體力學、細胞化學、生物學、免疫學以及激光和計算機等多門學科和技術于一體的先進科學技術設備。它被廣泛應用于臨床醫學、細胞學、生物學、微生物學、制藥學、生殖學等領域，是現代科學研究中的先進儀器之一，被譽為實驗室的"CT"。

1 流式細胞儀的工作原理和技術指標

1.1 流式細胞儀工作原理

圖1為流式細胞儀基本結構。它主要有四部分組成：流動室和液流系統；光源與光學系統、信號收集與信號轉換系統、計算機與分析系統。具有分選功能的流式細胞儀還包括分選系統。將待測細胞熒光染色后制成單細胞懸液，在鞘液的包被下單行排列，依次通過流動室檢測區域。以激光作為激發光源，垂直照射檢測區域的樣品流，被熒光染色的細胞在其照射下，產生散射光和激發熒光，它們同時被前向光電二極管和側向90°方向的光電倍增管接收。前向小角度的光散射信號（forward scatter,FSC）反映了細胞體積的大小；側向90°方向的光散射信號（side scatter，SSC）反映了細胞內顆粒的復雜情況。激發熒光信號代表了所標記的被測細胞內部顆粒的信息。這些光信號轉化成電信號，被傳送到計算機，經A/D轉換器傳輸到微機處理器形成數據文件，保存到計算機上，以備脫機后的數據處理和分析。細胞的分選是將待測液滴充以正負不同的電荷，讓其在高壓電場的作用下偏轉，落入不同的收集容器中，從而實現細胞的分離。

圖 1 流式細胞儀結構示意圖

1.2 流式細胞儀性能的技術指標

流式細胞儀性能的技術指標主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、分析參數多少及分析、分選速度及純度等。熒光分辨率是指分辨兩個相鄰峰的最小距離，通常用變異系數（CV值）來表示。現在市場上主流型號的熒光分辨率小于2.0%，有的甚至在1%之內。熒光靈敏度反映了儀器探測最小熒光光強的能力，一般用熒光微球上可測出的熒光（FITC）的最小分子數來表示。目前儀器可以達到100以內。一般分析速度為500-10000個細胞/s，分選速度控制在1000個細胞/s以下，分選純度>98%,有的儀器（如 MoFLo High-Performance Cell Sorter）分析速度可達100000個細胞/s，分選速度可達70000個細胞/s，分選純度>98%。應用方向不同，分析參數的多少差異較大，少的（如Guava PCA-96）可以分析3個熒光參數和1個散射信號，多的（如CyFlow SL）可以分析13個熒光參數和3個散射信號。

2 流式細胞儀的應用

2.1 在臨床上的應用

細胞癌變過程中伴隨細胞DNA含量的改變，DNA非整倍體細胞是惡性腫瘤的特異性標志。流式細胞儀的FSC能夠給出這些信息，在腫瘤的早期診斷和鑒別診斷中有著很重要的作用；早在80年代人們發現特定T細胞亞群可以反映AIDS患者的臨床狀態，而流式細胞儀可以對這些T細胞亞群進行檢測，為AIDS的診斷、治療提供有用信息；流式細胞儀借助于各種熒光染料測定一個細胞的多種參數完成白血病及淋巴瘤的診斷，準確率達90%左右，較傳統形態學檢查準確性提高10%-20%；流式細胞儀對淋巴細胞及其亞群數量的檢測，可以探索疾病的發病機理、病程、預后，指導臨床治療方案。

2.2 在生物學及微生物學上的應用

從早期到現在，在細胞及細胞器方面很多已被人們所接受的科技，都經流式細胞儀研究過。在細胞功能的早期研究中，研究者僅能通過觀測微生物的吞噬來研究噬中性粒子,而流式細胞儀可以通過它們的大小、形狀、抗體及吞噬過程中微生物種類、數量的變化更深入的辨別、研究這些噬中性粒子；氧自由基的實時、單細胞繁殖評價，DNA倍體分析，細胞循環中細胞增殖和凋亡分析等都會用到流式細胞儀；流式細胞儀對細胞周期可以輕松分析，促進了以此為基礎的植物學的發展，輔以成像儀器，流式細胞儀可以對微生物的成長、繁殖進行3-D研究。

2.3 在生殖學及制藥學上的應用

利用對精子DNA進行無害標定的DNA染料(如Hoechst 33342)或H-Y抗體都可以對精子進行檢測和分類，完成生殖學上的要求；FCM檢測腫瘤細胞的耐藥相關蛋白的表達水平，對檢測臨床腫瘤化療效果及藥物的選擇有一定的意義。此外，流式細胞儀在細胞毒，可溶性蛋白質分子，鈣離子濃度檢測等都有很廣泛的用途。此外，流式細胞儀在細胞毒，可溶性蛋白質分子，鈣離子濃度檢測等都有很廣泛的用途。

3 流式細胞儀的最新發展

3.1 儀器功能專業化

Partec CyFlow、BD FACSCount可以實現CD4,CD8,CD3絕對計數，用于HIV檢測的經濟普及型流式細胞儀。

3.2 儀器全面自動化

免疫標本制備儀、組織樣本制備儀和樣品前處理儀在實驗中得到廣泛應用。不同規格的多孔板或多試管自動進樣器加速了自動化進程。Epics XL、FACSCalibur 等主流廠家儀器都實現了自動化。

3.3 多色多參數分析迅速發展，分析、分類速度加快

新興熒光探針的不斷開發和儀器軟、硬件的逐步更新，流式細胞儀的多色熒光分析得到了迅速發展，對細胞亞群的識別更準確、更精細。

3.4 儀器小型化

適應實際需要的小型化、便攜式流式細胞儀也是一個發展的趨勢。最近幾年，微流體流式細胞儀成為研究的熱門方向，在這方面的研究也越來越多，取得了一定的科研成果。

3.5 儀器功能增強化

鑒于拉曼光譜易于識別的特點，Dakota A. Watson 等對能夠探測拉曼光譜的流式細胞儀進行了研究，這將使細胞的多參數測量提升一個檔次。

3.6 理論的新發展

An-Shik Yang等采用SIMPLEC迭代算法對流式細胞儀液體流動的理論模擬結果與文獻公布的實驗數據吻合很好，為微流體流式細胞儀的流體室設計提供了理論參考。

另外，試劑盒熒光試劑、液相芯片技術、定量流式細胞分析、儀器模塊化等也是流式細胞儀的發展趨勢。

4 未來展望

本文對流式細胞儀的原理、應用、發展現狀和趨勢作了簡明扼要的論述，使科研者和使用者有一個更深刻的了解和認識。隨著科學技術的進步，流式細胞儀專業化區分更加明顯，科研型大型儀器和普及性應用儀器成為兩個主流；隨著光電技術的發展，相信流式細胞儀能夠在測量多色熒光參數的時候，給出多參數分析結果，同時完成分類，實現實時同步分析的功能，這對臨床醫療快速診斷意義重大。

本文轉載自作者趙書濤等人，材料牛石小梅編輯整理。