ACS Nano：生物基質中納米粒子的表征

【引言】

工程納米材料在包括腫瘤治療、醫學成像、抗菌劑制備等的生物醫藥領域有著廣泛的應用。然而，就目前研究來看，我們對納米粒子與生物分子之間的相互作用及納米粒子輸送至細胞后的表現知之甚少，一定程度上阻礙了納米材料在生物醫學領域的發展。

納米粒子應用于細胞內存在潛在的危險性。雖然過去幾十年里有關納米安全性的研究急劇增加，但是關于功能納米材料的毒性同其物理、化學性質的關系一直沒有明確的解釋。此外，實驗中體內與體外結果相互矛盾的情況也引起了人們的關注。而這都源于當前研究缺乏一種可靠的生物基質中納米粒子的表征方法。

納米粒子在體外合成并修飾后，進入體內會吸引蛋白質等生物分子在其表面形成蛋白暈，改變表面的理化性質及電荷，從而使得粒子與粒子之間的排斥力改變，相互碰撞，形成團聚體。此時如果增加給藥劑量，則會達到一個生物可利用劑量，不可否認，當功能納米粒子處于一種多相團聚體狀態或存在于復雜的生理環境中時，當前的技術不足以確定生物可利用劑量。因而，開創一種可以在生物基質中準確表征納米材料的可靠方法對于功能納米材料在生物醫藥領域的應用十分必要。

【成果簡介】

近日，英國斯旺西大學的Huw D. Summers教授（通訊作者）團隊在ACS Nano上發表了題為“Characterizing Nanoparticles in Biological Matrices: Tipping Points in Agglomeration State and Cellular Delivery In Vitro”的研究論文，文中就目前對于生物基質中納米粒子可靠表征手段的缺乏，提出了一種利用低溫快照取樣的團聚體三維重建及TEM表征生物基質中納米粒子的方法（3-D CSS-TEM），達到量化“生物可利用劑量”目的。

【圖文導讀】

圖1：納米顆粒在生物基質中團聚

（a） 20 nm和40 nm的PS納米顆粒同正常血清培養基（NSCM）及減少血清的培養基（RSCM）中的TK6細胞孵育24小時后，細胞平均攝取量（歸一化納米顆粒熒光值/細胞）；
（b, c）熒光顯微鏡照片，其中紅色為細胞膜，綠色為納米顆粒，可以看出在50 nM給藥量時，20 nm的PS納米顆粒大量吸附與RSCM中TK6細胞表面。

表1：

在給藥和血清環境（NSCM / RSCM =正常/減少的含血清培養基）上的動態光散射表征聚苯乙烯納米顆粒團聚狀態和表面電荷（ζ電位）表征使用累積量（“Z-平均”）分析方法

圖2：使用低溫快照取樣及TEM對團聚體狀態PS納米顆粒進行表征

圖中電子顯微鏡照片中a/b/c/d均為20 nm PS顆粒，g/h均為40 nm PS顆粒CSS-TEM表征后結果，展示了在給藥量為10或者50 nM 1小時后納米顆粒的團聚狀態；

（b）和（e）的不同與納米顆粒有團聚更大的趨勢是吻合的；

（c. f. i）分別為通過相應的CSS-TEM數據得到的團聚分布圖。

圖3:20 nm PS納米顆粒的細胞遞送劑量調整

（a / b）通過旋轉測量的五種不同尺寸團聚體的體積及面積；
使用通過約100個圖像傾斜系列實驗收集的電子顯微照片來測量不同尺寸的團聚體（參見，視頻S1為全分辨率視圖）；

（a）這些測量數據（圓圈）經驗地驗證了用于將2-CSSTEM團聚體面積數據轉換為估計的團聚體體積（線=轉換的CSS-TEM數據）的縮放模型；

（c / d）估計的團聚體積分布，
通過將標度模型應用于2-D CSS-TEM數據獲得的分布，在（NSCM，藍色）或減少（RSCM，紅色）含血清培養基中正常施用的10或50nM的納米顆粒劑量；

（e / f）細胞熒光分布，與單個細胞給藥體積幾乎成線性關系，
從圖1a所示的組合的成像細胞計數據構建的每個細胞的納米顆粒劑量（帶有重疊輪廓的直方圖）；

（g / h）樣品在（e/f）所示分布下的熒光顯微照片（綠色=納米顆粒），
隨著團聚體尺寸不均勻性（c / d）增加遞送劑量（e / f）中的細胞與細胞之間的差異顯著增加。

圖4：通過納米粒子團聚轉化50nM給藥劑量的20nm PS

（a）估計的在正常（NSCM，藍色）或還原（RSCM，紅色）含血清培養基中的不同團聚狀態下的納米粒子總量作為團聚體數量百分比和團聚體積的乘積；?

（b）在每個血清環境中，給藥劑量的累積分布函數，涵蓋從最大尺寸到最小尺寸的團聚體。

圖5. DLS測試

從DLS研究（表1）中提取的20nm PS和40nm PS聚集體流體動力學尺寸分布數據（星號），并與通過CSS-TEM（圓圈）直接測量的附聚物Feret直徑測量值進行比較。

（a / b / g）為使用水作為分散劑收集的結果，單獨測量的主要尺寸分布，還包括從滴鑄TEM顯微照片獲得的納米顆粒直徑（綠線）以提供單個納米顆粒相對于團聚物的尺寸參考點（即主要尺寸對照）；

給藥后1小時測量大小分布（黑色），正常（NSCM，藍色）或還原（RSCM，紅色）血清中的10nM（左圖; a / c / e / g / h）或50nM（右; b / d /媒體；

包括NSCM和RSCM的DLS尺寸分布作為介質對照檢測血清分子的光散射背景以確保目標納米顆粒可靠地檢測。

圖6.單獨使用DLS檢測異常聚集狀態：BASF Levasil二氧化硅納米粒子（SiO₂）

（a / c）DLS測量的16nm SiO₂動態光散射粒徑分布；

（b / d）DLS測量的85nm SiO₂納米顆粒尺寸分布（星號）。

圖7：納米SiO₂對正常或含血清培養基細胞活力和DNA損傷的影響

含有生長培養基的（NSCM，藍色）或減少血清（RSCM，紅色）培養基中，將TK6細胞暴露24小時至（a）16nm SiO₂或（b）85nm SiO₂（n = 6，誤差線= SD）。 暴露對細胞活力（細胞生長/細胞毒性）的影響用相對于未暴露的對照培養物的相對種群倍增（系）進行評估。 通過雙核細胞微核率評估DNA損傷（條），直到細胞活力降低到50％以下。 （●，?，★）在p <0.05，p <0.01和p <0.001的情況下，相對于未控制的對照的響應統計學顯著性；

（a）在> 15nM的施用劑量下，16nm的SiO₂在血清環境中顯示出明顯不同的細胞活力趨勢；

（b）相比之下，無論血清環境如何，85nm SiO2暴露的細胞活力數據保持高度相似。

圖8：含有正常或含血清培養基的SiO₂納米顆粒的細胞傳遞

為了解在正常（NSCM，藍色）和還原（RSCM，紅色）血清環境中的二氧化硅納米顆粒的細胞遞送，在暴露24小時后進行切片細胞的電子顯微鏡，使用能量色散X射線（EDX）分析以確定納米顆粒（假色綠色）。

（a / b）與NSCM（a）相比，在血清環境中，16 nm二氧化硅（73nM劑量）的細胞遞送顯著變化，觀察到與RSCM中的細胞膜結合的納米顆粒的量更大（b）；

（c/d）相比之下（，無論血清環境如何，85nm SiO₂（0.5nM劑量）的細胞遞送保持高度相似。 比例尺= 1微米。

【小結】

本文提出了一種新的表征生物基質中納米粒子的方法3-D CSS-TEM，可以實現對多相團聚狀態的納米顆粒及生理環境中的納米顆粒的表征，這對于納米醫藥領域把控給藥劑量，理解細胞遞送、攝取及毒性十分有利。

文獻鏈接：Characterizing Nanoparticles in Biological Matrices: Tipping Points in Agglomeration State and Cellular Delivery In Vitro.?(ACS Nano, 2017, DOI: 10.1021/acsnano.7b03708 )

本文由材料人編輯部生物材料組Jing供稿，材料牛編輯整理。

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