中科院化學所高明遠JACS：雙比率熒光探針實現活體MMP-9和pH變化的實時監測

【引言】

近來，腫瘤微環境在腫瘤的復發和轉移中的作用受到腫瘤研究者的高度關注。腫瘤微環境中充斥著大量諸如基質金屬蛋白酶（MMPs）的蛋白酶類家族，MMPs不僅和腫瘤轉移相關，還與細胞凋亡、血管生成、腫瘤生長有關。通常MMPs的檢測是利用小組織活檢或體內熒光等方式,小組織活檢不能完全反應MMPs在腫瘤中的整體分布，體內熒光方式不能提供MMPs表達的定量信息。

在腫瘤微環境中除了MMP的異常表達外，由葡萄糖代謝改變和葡萄糖攝取增加引起的pH值降低也是腫瘤的另一個重要特征。然而常用的pH響應性熒光探針通常會受到許多外界因素的干擾，而影響活體腫瘤pH的檢測。相比之下，比率型熒光探針可以很好的緩解外界干擾，并可實現pH的定量檢測。然而，目前研究的成像探針僅可用于腫瘤微環境單一方面異常因素的檢測，但與腫瘤相關的異常改變通常是多方面并且相互之間是強烈相關的。因此，對于可同時檢測腫瘤相關蛋白酶（如MMPs）和細胞外pH值的探針的研究成為當下亟待解決的研究熱點。

【成果簡介】

近日，中科院化學所高明遠教授（通訊作者）團隊在JACS在線發表了一篇題為“Dual-Ratiometric Target-Triggered Fluorescent Probe for Simultaneous Quantitative Visualization of Tumor Microenvironment Protease Activity and pH in Vivo”的文章，介紹了一種雙比率熒光探針，實現了MMP-9過表達和腫瘤微環境pH異常的定量可視化，闡明其空間異質性并且協同的指示了體內腫瘤入侵過程。該研究最大的創新點在于通過無創傷多模態成像對多種腫瘤微環境特征信號進行定量和實時檢測。研究者對所設計探針一般概念的展示可能為體內異常腫瘤特征研究提供了一種強有力工具。

【圖文導讀】

示意圖 靜脈注射納米探針后探針通過受損血管進入腫瘤組織

納米探針一旦進入腫瘤組織內，MMP-9將對連接ANNA（pH敏感的熒光染料）與Fe₃O ₄納米顆粒連接的肽接頭進行切割，使ANNA的熒光得到活化。通過比較ANNA的可變激活發射和Cy5.5的恒定熒光，可以對MMP-9活性進行量化并作圖。在這種設計中，Fe₃O ₄顆粒載體不僅作為ANNA的猝滅劑，而且還作為腫瘤的磁共振成像（MRI）的造影劑。

圖1. 納米探針的系列表征?????????????

a） 納米探針結構示意圖

b） Fe₃O ₄納米顆粒的TEM表征

c） Fe₃O ₄納米顆粒的的UV-vis-NIR光譜

d） 質子化/去質子化誘導的ANNA結構轉變；Cy5.5的化學結構；不同pH下ANNA和Cy5.5的熒光光譜圖。

圖2. 納米探針的體外熒光表征

a） 納米探針與激活的MMP-9作用不同時間后在455 nm和650 nm激發下的熒光光譜

b） ANNA(綠色)和Cy 5.5(紅色)熒光峰值強度隨時間的變化

c） 納米探針與濃度的MMP-9共孵育后的熒光光譜

d） 固定孵育時間為30分鐘，ANNA和Cy5.5（IANNA / ICy5.5）的積分發射強度比率與激活的MMP-9濃度之間的線性關系（線性擬合結果顯示體外MMP-9的檢測極限為0.74nM，置信水平為99.9％）

e） 納米探針孵育6小時后LS180細胞（頂行）和人成纖維細胞（對照細胞（底行））的共聚焦顯微鏡圖像，根據染料的不同發射波長用不同的通道成像（細胞核：Hoechst染色，標尺為10μm）。

圖3. 荷瘤小鼠熒光成像和MR成像表征

上圖：荷瘤小鼠相應明場圖像上的腫瘤部位Cy5.5和ANNA信號變化的熒光圖像（右框1-9：心臟，肝臟，脾臟，肺臟，腎臟，腸道，骨骼，肌肉和腫瘤等）。

下圖：靜脈注射納米探針之前和注射后不同時間點獲得的荷瘤小鼠的T2加權MR圖像顏色編碼圖（右框：具有類似結構的不含FA的納米探針的T2值隨時間變化作為對照）。

圖4. MMP-9和pH值的體內成像圖

a-b） MMP-9在體內活性強度的等高線圖和腫瘤部位的pH值（白色虛線表示組織分析得到的腫瘤橫截面）

c） 三個相鄰組織的H&E切片以及普魯士藍染色。

圖5. MMP-9和pH值的相互關聯分析

a） 瘤內注射PBS（pH 6.2）調節腫瘤pH后MMP-9活性的變化

b） 通過比色測定（左）獲得的MMP-9的定量表達水平和多模態成像（中）獲得的相對MMP-9活性，以及使用ANNA熒光發射（右）量化的腫瘤微環境pH

c） 在D + 0，D + 2和D + 4獲得的腫瘤的定量pH和MMP-9表達圖譜（在從黑色到黃色的顏色條陰影中，用于讀取MMP-9表達水平，每個格對應0.25個單位）

d） 4天內皮下腫瘤的生長照片

e） 上圖：H＆E染色的組織載玻片的顯微圖像; 下圖：兩個相鄰載玻片用E-鈣粘蛋白染色（紅色）和MMP-9表達（綠色）（標尺：200 μm）的免疫熒光顯微圖像的組合。橙色箭頭指向健康組織和MMP-9高度表達的腫瘤組織之間的分界線。

【小結】

基于FRET系統成功構建了一種蛋白酶觸發的雙比率型熒光探針，這個探針包括Fe₃O₄納米粒子，pH敏感的比率型熒光染料（ANNA），近紅外染料（Cy5.5），MMP-9特定的肽底物接頭，和腫瘤活性靶向部分葉酸（FA）。系統的研究進一步表明雙比率測量系統不僅提供腫瘤中MMP-9局部蛋白酶的活性和pH的實時信息，并且可對信息進行量化。目前的研究還表明MMP-9的過度表達在時間和位置上都與體內異常的pH有很好的相關性。這兩個特征的協同效應是決定惡性腫瘤異質侵襲的主要因素。這一研究為后續腫瘤相關的蛋白酶及細胞外較低的pH值的腫瘤微環境與腫瘤侵襲、增殖和轉移之間的聯系提供了新的研究思路和方法。

?文獻鏈接：Dual-Ratiometric Target-Triggered Fluorescent Probe for Simultaneous Quantitative Visualization of Tumor Microenvironment Protease Activity and pH in Vivo（J. Am. Chem. Soc.，2017，DOI: 10.1021/jacs.7b08900）

本文由材料人編輯部南渡編譯，劉宇龍審核，點我加入材料人編輯部。