Nature子刊：用于發現生物活性小分子的第二代DNA模板化大環化合物庫

【引言】

新的生物活性小分子配體的發現仍然是生命科學研究界的核心努力方向。常見的小分子發現方法依賴于篩選化學化合物的大型集合（庫）。在典型的篩查活動中，文庫成員在不同的地點單獨進行分析以獲得所需的生物學活性，因此與篩查相關的時間，精力和費用與文庫大小成正比。雖然化學文庫的篩選取得了許多重要的成功，但大型化學文庫的開發，維護和高通量篩選需要基礎設施，資源和物流，而大多數研究小組都無法獲得這些資源。此外，篩選試驗的離散性質可能需要大量不穩定的生物材料，這些生物材料需要按比例放大以適應篩選的文庫的大小。相比之下，選擇方法在單個實驗中評估整個文庫，通常需要的生物材料的量少于單個微量滴定板測定所需的量。此外，選擇不需要基礎設施來分離，測定或操縱單個文庫成員，并且以基本上獨立于文庫規模的方式消耗資源。

DNA編碼化合物庫(DNA Encoded Compound Library，簡稱DEL)是合成分子的混合物，每個合成分子由共價連接的DNA標簽編碼。自發現以來，這項技術已經得到很好的發展。DEL可以在一種解決方案中快速且便宜地同時測試整個文庫，以便與感興趣的目標結合，并且只需要少量的生物材料（每個選擇約5-50μg的典型目標蛋白）。DEL技術是組合化學和分子生物學的完美結晶，并在高通量測序技術的迅速發展下得到了巨大的推動，使得先導化合物的篩選變得前所未有的快捷和高效。

盡管有這些優勢，但絕大多數DEL仍然局限于制藥公司，圍繞其在工業中的開發和使用的許多研究進展仍未公開。雖然已經報道了一些合成DEL的初始策略。在一些情況下，這些方法使得構建化合物數量高達數百萬甚至數十億的文庫成為可能。但伴隨著的卻是隨著文庫大小的增加，可被確認經歷預期反應途徑的文庫成分卻減少。重要的是，DEL的質量取決于由其DNA標簽編碼正確合成的分子的比例，而文庫的質量又直接影響選擇結果的可靠性。可是，在大多數情況下，每個化學偶聯步驟后都進行產物的純化是不可行的，這導致連接DNA標簽的截短的副產物污染甚至控制了文庫。

當使用低效積木作為文庫設計的一部分來挑戰諸如大環化或偶聯反應等化學轉化時，這種限制可能變得特別成問題。因此，使用傳統的方法來生成高質量的大環化合物DEL可能是一個特別的挑戰，除非支架的大部分是預先形成的，而組合變化僅限于引入取代基，實際上這限制了文庫結構的多樣性。

因此，開發構建高度多樣化DNA編碼大環化合物庫的方法是一個具有挑戰性的目標，可以提供潛在的化學空間。 大環分子的生物醫學特性進一步突出了這些文庫的應用潛力。 目前，大約70種大環類藥物已被批準用于人類使用，超過35種大環類藥物處于臨床開發的不同階段。通常認為大環比其線性對應物具有更好的體內穩定性，并提供了靈活性和預組織之間的平衡，使得大環化合物可以跨越延伸的蛋白質結合位點進行相互作用，熵處理低于相應的線性分子。 后一個特征使它們在靶向表面或蛋白質 - 蛋白質相互作用方面很有前，而這些相互作用可能難以用常規小分子庫進行靶向。

【成果簡介】

DNA編碼文庫已經成為發現生物活性小分子的廣泛使用的資源，并且與傳統的小分子文庫相比具有顯著的優勢。近日，哈佛大學美國杰出化學家David R. Liu（通訊作者）在Nature Chemistry期刊上發表了題為“Second-generation DNA-templated macrocycle?libraries for the discovery of bioactive small molecules”的研究論文。在此項研究中里，作者開發并精簡了DNA編碼和DNA模板化文庫合成方法的多個基本方面，包括20×20×20×80正交密碼子的計算識別和實驗驗證，增強結構的化學和計算工具文庫成員的多樣性和藥物相似性，高效聚合酶介導的模板文庫組裝策略以及文庫分離和純化方法。作者及其團隊整合了這些改進的方法，以生成具有改善的藥物物理性質的第二代DNA模板庫，其中包含256,000個小分子大環化合物。該文庫體外選擇胰島素降解酶親和性產生新穎的胰島素降解酶抑制劑，包括異常效力和新型大環化合物（IC₅₀ = 40nM）之一。總的來說，這些發展使得以DNA為模板的小分子文庫成為用于生物活性小分子發現的更強大，可訪問，簡化和具有成本效益的工具

【圖文導讀】

圖1：DNA模板的大環化合物文庫合成示意圖

展示了先前描述的第一代（灰色）和第二代（黑色，彩色）庫合成的關鍵方面。在第一步中，連接在模板5'端的支架結構單元D與結構單元A進行偶聯，結構單元A最初通過可裂解的 bis(2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl) sulfone (BSOCOES) 連接子連接到相應的'反密碼子'DNA上。未反應的模板用乙酸酐加帽封端。連接子在高pH下被裂解，釋放結構單元A的氨基，隨后進行步驟2與構件B偶聯，隨后加帽和接頭裂解。在與生物素或PEG標記的Wittig試劑結構單元C偶聯后，用抗生蛋白鏈菌素標記的beads（第一代方法）或凝膠純化（第二代方法）下拉可以分離在所有三個步驟中成功反應的那些模板。高碘酸鹽處理裂解丙酰胺部分的二醇片段以提供乙醛酰基，其在溫和的堿性條件下經歷Wittig環化。成環產物在環化（第一代程序）時從beads上洗脫下來或在聚丙烯酰胺凝膠上純化（第二代程序）。 EDC，N-（3-二甲氨基丙基）-N'-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽; sNHS，N-羥基磺基琥珀酰亞胺鈉鹽。

圖2：第二代DNA模板文庫的正交密碼子集的鑒定

a）第二代模板庫的一般體系結構。連續的Ns不代表隨機序列，但表示各個密碼子的位置；

b）第二代圖書館的編碼系統；

c）用于計算正交密碼子集的DNA模板的建議模型；

d）DTS密碼子反應性的理想結果（表1）。數字表示相應的DNA模板（水平）和DNA-連接的試劑（垂直）之間反應的表觀轉化。綠色和紫色字段分別表示明顯的轉換和退火因子；

e）基于附加退火因子模型的反卷積方法（7）：將實驗獲得的反應性表格（3）轉換成預期的親和表格（4），其用額外的DTS反應（5）精制。幾何形狀代表各種密碼子和反密碼子; （2）和（5）表示相應的DTS反應（α，β，γ）的表觀轉換。

圖3：第二代DNA模板化大環化合物庫的構建模塊

a）能夠將新的支架結構并入DNA模板的合成路線，例如支架4I和4L；

b）腳手架在第二代大型循環庫中驗證和使用，紅色和綠色球體分別代表構件1和3的聯系；在第一代文庫中使用支架4A-4H（虛線框）；

c）經迭代選擇的構建模塊最大限度地提高了庫與Kihlberg的參數空間的重疊，用于口服生物可用分子。 DCM，二氯甲烷; DIPEA，N，N-二異丙基乙胺; DMF，N，N-二甲基甲酰胺; HBTU，2-（1H-苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽; TFA，三氟乙酸。

圖4：來自第二代大環文庫和第一代文庫的成員的物理參數分布

來自第二代大環文庫的物理參數顯示在x軸的上方，而來自第一代文庫的物理參數顯示在x軸的下方。 顏色表示在參考文獻中所描述的理想的“beyond rule of five”（bRo5）參數范圍內部（藍色）或外部（紅色）的值。

圖5：DNA模板庫的組裝方法

a）組裝第一代DNA模板庫；

b）用于第二代DTS庫的夾板連接組裝的修改版本。將連接片段的數量從兩個增加到三個，大大減少了所需的寡核苷酸合成的數量；

c）通過預備的酶促引物延伸的模板庫裝配策略。

圖6：體外選擇256,000元DNA-模板化的大環化合物庫用于結合IDe

a，b）在計算過濾九個結構相似的疏水結構單元（1J，1L，1M，1N，1T，3E，3H，3L，3R）之前（a）和之后（b）的IDE選擇結果。除去大量的非特異性噪音更突顯出豐富的DJP *系列大環化合物。化合物trans-DJPM和cis-DJIR是在無DNA下化學合成的，并且發現它們與第一代DNA模板化文庫中發現的反式-6bK和反式-6bA大環結構相當。確定的命中還包括一個無關的、新結構家族的CODVV大環。 R =（CH₂）₂O（CH ₂）₂NH₂；

c）通過熒光十肽切割測定確定的大環命中的濃度依賴性IDE抑制曲線。誤差線表示平均值的標準差。每次命中的順式和反式異構體的圖具有相同的顏色和標記形狀，但反式異構體為填充的符號和順式異構體為空心符號。 DJPM反式異構體比順式異構體更有效，但測試的其他命中卻觀察到相反的趨勢。

【小結】

本文開發并合成了第二代DNA模板化和DNA編碼的256,000個大環化合物文庫，適用于體外選擇和高通量DNA測序。在文庫合成過程中，作者開發并廣泛優化了DNA編碼和DNA模板庫技術的許多基本方面。這些進展包括以下內容：

（1）提出并實驗驗證了用于鑒定DTS文庫合成的正交密碼子的新模型，其導致20×20×20×80密碼子集足以支持多達640,000個成員的文庫。

（2）除了增加腳手架密碼子的數量（從8個增加到32個或80個）外，我們還開發了一種高效的DNA兼容的beads上Boc去保護方法，并驗證了許多新的構建模塊，這些構建模塊共同充分擴展了腳手架，構建模塊化大環的多樣性。

（3）開發了計算機腳本以幫助生成化合物文庫的計算機數據庫，并選擇能夠提高所得分子預測生物利用度的構建模塊。

（4）為DNA連接的小分子開發了新的分離和純化方法，使得DTS文庫更可靠，可擴展，高收益和成本效益更高，并且在選擇后能夠回收和回收文庫。

（5）開發了新的聚合酶輔助方法來合成具有5'化學修飾的DNA模板文庫。這些方法提供了對文庫質量的更精確控制，消除了與寡核苷酸混合物進行反應的必要性，并且通過在鏈霉抗生物素蛋白連接的beads上不可靠的固定和從標準沉淀方法的不良恢復而使材料損失最小化。

（6）最后，通過針對IDE的體外選擇驗證了新的文庫合成方案，導致發現對先前優化的IDE抑制劑6bK（IC₅₀ = 50nM）等效的大環trans DJPM，并且發現cis-DJIR（IC₅₀ = 40 nM），這是一種意想不到的IDE順式大環骨架配體IDE抑制劑，代表了一種新型的結合IDE的大環化合物。

文獻鏈接：Second-generation DNA-templated macrocycle?libraries for the discovery of bioactive small molecules.?(Nat. Chem., 2018, DOI:?10.1038/s41557-018-0033-8）

本文由材料人生物組Jing供稿。

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