無所不能 —— TEM 在水凝膠領域“玩”的也是非常溜的

【引語】

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水凝膠是一類在水中以物理交聯或者化學交聯形成的具有3D網絡結構，含水量極高的軟物質材料。水凝膠在生物醫藥方面具有很大的應用范圍和前景。因此，對水凝膠的表征也顯得尤為重要,特別是在超分子自組裝水凝膠的組裝結構表征上，TEM的應用十分廣泛。下面就簡單介紹一下有關TEM在水凝膠材料中的應用。透射電鏡是一種高分辨率、高放大倍數的顯微鏡，是材料科學研究的重要手段，能提供極微細材料的組織結構、晶體結構和化學成分等方面的信息。透射電鏡的分辨率為0.1～0.2nm，放大倍數為幾萬～幾十萬倍。

一、TEM（普通透射電子顯微鏡）的在水凝膠材料的常見表征應用：

由于電子束穿透樣品的能力低，因此要求所觀察的樣品非常薄，對于透射電鏡常用75～200kV加速電壓來說，樣品厚度控制在100～200nm。要得到更多顯微結構信息的高分辨率照片，一般需要場發射TEM。

1.TEM表征凝膠網絡結構

通過TEM的表征，可以作為判斷水凝膠材料的微觀形貌和結構的一種重要依據，特別是在對于超分子自組裝形貌結構的表征上，TEM表征是一種最直觀的表征技術手段。

（1）凝膠微觀三維網絡的表征：

水凝膠是一類在水中以物理交聯或者化學交聯形成的具有3D網絡結構材料。如圖一，POG10-den分子是又POG10多肽鏈和PAMAM接枝得到的，他們與天然膠原蛋白一樣可以成膠，POG10多肽鏈可以獨立形成三重螺旋結構，但是PAMAM分子是樹狀的大分子網絡，在水中形成球型組裝體，因此，POG10-den加熱下組裝成膠，在水中主要呈現的是球型的組裝聚集體(如圖一左)^?1，而天然膠原蛋白可以形成三重螺旋結構，其包含了由Gly-Pro-Hyp重復單元組成，進而自組裝形成纖維，最終相互纏結互穿形成三維的凝膠網絡（圖一中）¹。RSF/HPMC9（再生絲/羥丙基甲基纖維素）體系水凝膠擁有優越的力學性能，擁有較高的力學強度，抗壓模量達到1MPa以上。作者由此提出了一種可能的凝膠化機理，即HPMC分子與RSF分子之間的氫鍵和疏水相互作用可能對RSF/HMPC凝膠化行為產生協同作用。β-sheet的?RSF結構與HPMC之間的協同氫鍵作用形成了相互纏結的致密的交聯網絡（如圖一右）²，這對力學性能的提高起了關鍵作用。

圖一：

POG10-den分子的組裝結構聚集體（左），天然膠原蛋白形成的凝膠三維網絡（中），RSF/HPMC9體系的凝膠三維網絡結構（右）。

（2）微觀自組裝結構的表征以及自組裝結構的演變過程或者機理表征研究：

超分子自組裝結構形貌一般有納米帶、納米纖維、納米管、納米線、納米片、膠束球等。下面我們簡單介紹了易于形成凝膠兩種典型納米結構形貌。I3QGK短肽分子鏈在水中主要是β-sheet構像主導，在水中易于形成均一細長的納米帶結構（如圖二左）³，I3QGK納米帶是相對剛性的，其扭曲和/或螺旋的跡象相當有限，可能是由于Q氨基酸殘基的影響導致其β-sheet結構控制短肽分子形成平而長的納米帶結構。另外，類似的。利用開環聚合的方法得到的(G-EA)m-Tyrn短肽分子也通過自組裝形成了細長的納米纖維的結構形貌（如圖二右）⁴，進而相互纏結形成凝膠網絡。此外，超分子自組裝結構有時對某一因素具有依賴性，比如自組裝結構會隨著某一因素（如pH、溫度、時間等）的變化而改變，由此，TEM的表征顯得尤為重要，它的表征可以跟蹤表征每個時間段的某一時刻的組裝結構，從而清晰直觀的了解自組裝結構的額演變或生長過程，進而服務于超分子自組裝體系的機理研究。如圖三所示⁵，比較清楚的表征了樣品自組裝結構隨某一因素pH變化而變化的演變過程研究。即混合末端含兩親性肽后的DNA-和PNA(肽核酸)-在1、5、7天的演變過程，從第一天生成的有節距的納米纖維絲對結構隨時間的變化的趨勢，組裝結構逐步生長成為到第七天的納米纖維束。

圖二：直觀的表征小分子水凝膠微觀自組裝結構：納米帶（左）、納米纖維（右）

圖三：第一天的有節距的納米纖維絲對結構隨時間的變化的趨勢，組裝結構逐步生長成為到第七天的納米纖維束。

2.TEM表征凝膠體系微觀形貌尺寸

利用TEM的質厚襯度像（吸收襯度像）可以對樣品形貌進行表征，其中就包括樣品形貌的尺寸的大小、分布、排列等。如圖四左⁶，KE-F8多肽由于F（苯丙氨酸）氨基酸強烈的π-π相互作用，使得多肽主要呈現β-sheet結構，兩周后。多肽水溶液通過自組裝形成了更長的扭曲的納米帶結構，通過測量，清楚的表征出納米帶的寬度范圍在25-34nm。另外，YYAYY短肽中利用Y（酪氨酸）氨基酸中的側鏈基團的苯酚結構在催化作用下進行交聯作用，從而使得短肽分子自組裝形成了球型納米凝膠結構（如圖四中、右）⁷，通過TEM的表征和測量，中間的是TEM的大范圍的顯示圖，可以看到大量結構均一分布較為均勻的球型納米凝膠結構，進一步的小范圍高分辨的TEM圖（右圖）測得其球型納米凝膠的平均粒徑在200nm。當然，對于平均粒徑一般可以進行多點多次統計測量計算得出。

??圖四：左圖表征納米紐帶的寬度尺寸范圍為25-34nm，中、右兩圖表征納米凝膠的直徑尺寸約為200nm。

二、透射電鏡（TEM）的特殊應用

1、冷凍透射電鏡（Cryo-TEM）

2015年，國際著名期刊《自然》旗下子刊Nature Methods就將冷凍電鏡技術評為年度最受關注的技術。2017年，冷凍電鏡（Cryo-TEM）斬獲諾貝爾化學獎，也再次證明了Cryo-TEM技術的科學價值。國內冷凍投射技術大牛施一公曾言，就目前發展前景來看，冷凍電鏡技術是可與測序技術、質譜技術相提并論的第三大技術！Cryo-TEM通常是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設備，將樣品冷卻到液氮溫度（77K），用于觀測蛋白、生物切片等對溫度敏感的樣品。通過對樣品的冷凍，可以降低電子束對樣品的損傷，減小樣品的形變，通過對運動中的分子進行冷凍，即可進行高分辨成像，從而得到更加真實的樣品形貌。

C16-K2兩親性多肽鏈由于K（賴氨酸）氨基酸的側鏈基團氨基可以質子化和去質子化作用，使得該多肽分子具有一定的pH響應性，從而使得該多肽分子約在pH=7.5一下容易自組裝形成球型膠束結構，而在弱堿性環境pH=8附近主要形成細長的納米纖維結構，pH大于8.3，其自組裝結構主要會形成雙分子層的納米帶狀結構。如圖五⁸，直觀的表征自組裝結構隨某一因素pH改變而導致組裝體結構趨勢變化過程和真實形貌，(a) pH值為5時，只觀察到球形膠束結構。(b) pH值為8時溶液顯示細長的納米纖維結構(紅色箭頭)。 (c)在pH值9時，可以觀察到扁平的帶狀結構，同時也有跡象表明長纖維(紅色箭頭)類似于pH值8時形成的纖維。

圖五：隨pH變化而使得自組裝從pH=5的膠束球狀結構變成pH=8的納米纖維絲狀結構再到pH=9的納米帶狀結構。

2、高分辨透射電子顯微鏡（HR-TEM）

HR-TEM只是分辨率比較高，是透射電鏡的一種。它可將將晶面間距通過明暗條紋形象的表示出來。通過測定明暗條紋的間距，然后與晶體的標準晶面間距d對比，確定晶型。這樣很方便的標定出晶面取向，或者材料的生長方向。主要應用有：①晶體缺陷分析。廣義的講，一切破壞正常點陣周期的結構均稱為晶體缺陷，如空位、位錯、晶界、析出物等。這些破壞點陣周期性的結構都將導致其所在區域的衍射條件發生變化，使得缺陷所在區域的衍射條件不同于正常區域的衍射條件，從而在熒光屏上顯示出相應明暗程度的差別。②組織分析。除了各種缺陷可以產生不同的衍射花紋外，各種不同的晶體微觀組織也會對應有不同的像和衍射花紋，通過它們可以在觀察組織形貌的同時進行晶體的結構和取向分析。

如圖六（上，d,e）⁹以蘆薈葉凝膠制備碳量子點（CQDs），作者制備了粒徑范范圍為1.5nm-3.7nm，水動力直徑為2.67nm的球型CQDs，通過HR-TEM的表征，圖六上(d)和(e)為均勻間距為0.18 nm的CQDs晶格條紋圖像，對應于石墨碳的(100)衍射面。另外，如圖六（下，e,f）¹⁰，作者通過生物合成的方法制備納米銀粒子（BSN），從圖六下e圖可以看出，合成的BSN具有良好的分散性，多為十面體和二十面體形狀的球形結構。圖六下f圖給出了一個具有十面體形狀的納米顆粒。

圖六：

上圖（d, e）為CQDs的HR-TEM圖，晶格條紋間距0.18nm，下圖（e, f）為BSN粒子的HR-TEM圖，晶型多為十面體和二十面體形狀的球形結構。

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