中國藥科大學孫敏捷組Adv. Funct. Mater: ATP超敏型蛋白團簇用于腫瘤深層滲透及放大MRI引導的光熱治療

研究背景：

近年來，蛋白或基于蛋白的診療試劑（PBTA）受到越來越多科研工作者的關注。這其中，包括治療蛋白如細胞因子、單抗、生物酶等，可以作為生物大分子藥物，在抗腫瘤治療中表現出優良的活性。另外一些則是生物相容性蛋白，如白蛋白、血紅蛋白、轉鐵蛋白等，可以作為治療性小分子藥物、染料或診斷劑的載體。然而，目前已報道的蛋白診療劑由于其在腫瘤中蓄積、滲透或選擇性差等種種問題，很大程度上限制了其體內應用以及臨床轉化。我們知道，納米粒子的粒徑在腫瘤滯留、滲透中扮演著至關重要的角色。通常來講，粒徑較小的納米粒子具有較強的滲透能力，卻同時伴隨著較差的腫瘤滯留；而粒徑較大的粒子恰恰相反，表現出較強滯留及較差滲透。目前已開發的大部分蛋白診療試劑粒徑均分布在2-20 nm，該小粒子很容易通過腎清除排出體內，其體內生物半衰期不到1小時，使得療效大打折扣。

成果簡介：

近期，中國藥科大學藥學院孫敏捷教授團隊基于“沙拉（SALAD，Small-Assembling-LArge-Disassembled）”式遞藥原理，開發出一種細胞外微環境ATP超敏蛋白團簇（DEP/GdCuB）成功攻克這一瓶頸。研究人員首先合成了包載了Gd³⁺和CuS的診療一體化白蛋白納米小粒子（GdCuB,?9?nm），并與ATP敏感材料糊精-乙二胺-苯硼酸（DEP）組裝形成蛋白團簇（DEP/GdCuB, 120 nm）。較大的蛋白團簇不僅能夠延長小粒子的循環半衰期，還能夠使得小粒子在血液中的T₁加權成像效果減弱，降低背景信號。而當團簇蓄積到腫瘤部位，胞外的ATP分子能夠快速反轉DEP的電荷，從而觸發GdCuB的釋放，促進深層滲透以及T₁加權MRI的激活。這一策略同時實現了蛋白粒子在腫瘤部位有效蓄積及深層滲透，并用于放大T₁加權磁共振成像（MRI）引導的光熱治療。該成果近日以“Size Switchable Nanoclusters Fueled by Extracellular ATP for Promoting the Deep Penetration and MRI Guided Tumor Photothermal Therapy”為題發表在知名期刊Advanced Functional Materials雜志上。

圖文導讀：

圖一、ATP超敏性蛋白團簇（DEP/GdCuB）的制備及其體內作用原理示意圖

（A）在血液循環中，將蛋白小粒子制備成較大的團簇能夠延長其循環半衰期，從而增強腫瘤蓄積，同時在血液循環中T₁加權成像處于OFF狀態；

（B）當蛋白團簇遞送至腫瘤部位時，細胞外的ATP能夠快速觸發團簇解組裝以及蛋白小粒子的釋放，實現深層滲透及T₁加權成像的激活。在1064 nm激光照射下，增強的腫瘤蓄積及滲透顯著的增強了蛋白診療小粒子的光熱治療效果。?

圖二、納米團簇的理化性質表征及ATP超敏感性能表征

（A）在?GdCuB-FITC中加入不同量的DEP后熒光發射光譜變化；（B）制備團簇前后粒徑變化；（C）制備團簇前后Zeta電位變化；（D）ATP觸發DEP電荷反轉示意圖；（E）加入不同量的ATP后，不同苯硼酸接枝率材料的zeta電位變化(DEP0接枝率最低，DEP2接枝率最高)；（F）加入不同量的ATP后，不同接枝率團簇的蛋白小粒子釋放；（G）熒光共振能量轉移（FRET）證明其ATP敏感解體行為；（H）透射電鏡TEM觀察GdCuB，DEP/GdCuB以及DEP/GdCuB+0.1mM ATP形貌。

?圖三、GdCuB的光熱效應以及ATP激活的熒光成像和T₁加權MRI成像

?（A）GdCuB和DEP/GdCuB的UV-Vis掃譜圖；（B）1064 nm激光照射后，去離子水、GdCuB以及DEP/GdCuB的紅外熱成像圖；（C）GdCuB以及DEP/GdCuB在激光和非激光處理下對細胞的殺傷作用；（D）ATP觸發DEP/GdCuB-FITC的熒光恢復譜圖；（E）ATP激活DEP/GdCuB-Cy7的近紅外熒光信號放大成像；（F）GdCuB，DEP/GdCuB以及DEP/GdCuB+0.1mM ATP的T₁加權MRI成像圖；（G）GdCuB，DEP/GdCuB以及DEP/GdCuB+0.1mM ATP的T₁加權MRI成像弛豫系數測定。

圖四、ATP激活的腫瘤深層滲透研究

（A）4T₁細胞3D腫瘤細胞球驗證DEP/GdCuB-FITC加ATP前后滲透深度；（B） 細胞球60μm深度的2.5D圖像分析；（C）流式細胞儀測定加入ATP前后FITC陽性細胞數；（D）流式細胞儀測定加入ATP前后不用時間的細胞平均熒光強度；（E）注射GdCuB-FITC或DEP/GdCuB-FITC 24小時后腫瘤切片。

圖五、體內組織分布、藥動、MRI成像以及紅外熱成像

（A）小動物熒光成像系統觀察GdCuB-Cy7及DEP/GdCuB-Cy7的活體分布；（B）24 h后離體臟器及腫瘤的熒光信號定量分析；（C）藥動學研究；（D）GdCuB及DEP/GdCuB的T₁、T₂加權磁共振成像；（E）激光照射不同時間后，注射了Saline、GdCuB及DEP/GdCuB的小鼠紅外熱成像圖。

圖六、體內抗腫瘤藥效評價

（A）注射不同制劑后4T₁荷瘤鼠的腫瘤生長曲線；（B）給藥16天后，代表性離體腫瘤照片；（C）給藥16天后，小鼠各組瘤重統計分析；（D）給藥期間小鼠體重監測；（E）16天處理后，腫瘤組織的H&E及TUNEL切片染色。

總結與展望：

在這項工作中，基于“沙拉（SALAD，Small-Assembling-LArge-Disassembled）”式遞藥原理，我們報道了一種優化蛋白診療試劑體內應用的新策略。成功的打破蓄積和滲透的平衡，實現了蛋白診療試劑在腫瘤部位的強蓄積以及深層滲透。同時，利用腫瘤微環境細胞外的ATP作為蛋白團簇的觸發器，通過苯硼酸和ATP的化學反應驅動陽離子材料電荷反轉及蛋白小粒子釋放。此外，電荷反轉原理表明，該策略同樣具有很高的潛力推廣應用于表面負電性功能化的納米小粒子，如Fe₃O₄，Au，量子點等，實現諸如此類納米小粒子的增效減毒目標。總的來說，該策略為推進蛋白診療試劑的臨床轉化打下了堅實的基礎。

文獻鏈接：

Size Switchable Nanoclusters Fueled by Extracellular ATP for Promoting Deep Penetration and MRI‐Guided Tumor Photothermal Therapy. Advanced Functional Materials, 2019: 1904144.DOI: 10.1002/adfm.201904144.

本文由中國藥科大學孫敏捷課題組供稿。

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