王麗麗＆林君Chem. Eng. J.：線粒體靶向的黑色素@mSiO2蛋黃殼結構用于近紅外二區驅動的光熱-熱動力/免疫治療

【引言】

基于近紅外激光照射的光熱療法(PTT)由于其無創、無有害副作用、適用性廣，在癌癥治療中具有廣闊的應用前景。與傳統的NIR-?I光學窗口(650-950 nm)相比，近紅外二區(NIR-Ⅱ)生物窗口(1000-1700 nm)允許更深的組織穿透深度，更低的信噪比，更高的最大允許曝光。天然黑色素在近紅外區具有良好的吸收和較高的光熱轉換效率，在生物醫學和納米技術領域顯示出很大的前景。然而，光線穿透受限可能導致腫瘤消除不完全，特別是激光照射區域邊緣殘留的腫瘤細胞，導致腫瘤復發并向遠處器官轉移。近年來，包括檢查點阻斷治療、細胞因子治療以及單克隆抗體治療在內的多種免疫治療方法在臨床研究中被用于探索治療癌轉移性。然而，大多數癌癥本身具有免疫抑制性，很難通過目前的免疫療法加以控制。因此，結合光熱治療等局部療法，可以巧妙地克服免疫療法的局限性，最大限度地發揮兩種治療方式的優點，既能激活免疫系統，實現對癌癥的長期免疫，增加整體治療的選擇性。

基于以上研究背景，近日，青島農業大學王麗麗教授和中科院長春應化所林君教授團隊通過差速離心法提取均勻的墨魚囊黑色素，在正硅酸四乙酯(TEOS)和十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)存在下，以均三甲苯作為擴孔劑，從而合成了mSiO₂包覆黑色素的蛋黃殼納米結構(MS)；并在SiO₂殼層接枝上-NH₂后，(3-羧基丙基)三苯基溴化磷(CTPP)與-NH₂共價鍵合，得到CTPP改性的納米顆粒；最后，將AIPH加載到MS-CTPP的大介孔中，構建AIPH@MS-CTPP納米結構 (圖1)。

該平臺具有以下優點：1)?SiO₂和天然黑色素納米顆粒均具有良好的生物相容性和生物安全性；2)?SiO₂殼內接枝的(3-羧基丙基)三苯基溴化膦(CTPP)賦予MS線粒體靶向性；3)?大介孔可顯著增加AIPH的負荷量，進而促進烷基自由基的生成，殺傷腫瘤細胞；4)?NIR-Ⅱ介導的PTT和TDT具有較高的最大允許輻照和組織穿透深度；5)?天然黑色素納米顆粒能使M2 表型巨噬細胞復極化成抗腫瘤M1表型，誘導PTT和二氧化硅雙介導的抗腫瘤免疫反應；6)在1064 nm近紅外二區激光照射下，通過黑色素的光熱轉化，實現了光熱治療和熱動力治療的協同治療，也實現了光熱治療和二氧化硅介導的免疫增強作用。

該成果以“Mitochondrial Targeted Melanin@mSiO₂?Yolk-shell Nanostructures for NIR-Ⅱ-driven Photo-Thermal-Dynamic/Immunotherapy”為題，發表于國際頂級期刊《Chemical Engineering Journal》(文章DOI：10.1016/j.cej.2022.134869)。青島農業大學為該論文第一完成單位，中科院長春應化所、山東大學和山東第一醫科大學青島附屬醫院為合作單位。張宇同學和王琦同學為該論文的共同第一作者，王麗麗教授、林君教授、丁彬彬特別研究助理為共同通訊，紀奕順主治醫師和范麗媛博士為論文的合作者。該項研究工作獲得國家自然科學基金、中澳政府科技合作項目、博士后創新人才支持計劃以及青島農業大學高層次人才基金等項目的資助。

【圖文詳情】

示意圖1：AIPH@MS-CTPP及其協同PTT、TDT和免疫療法抑制腫瘤生長的示意圖

圖1?AIPH@MS-CTPP納米顆粒的表征

a-d) 黑色素、MS、MS-CTPP和AIPH@MS-CTPP的TEM圖像

e-h) 黑色素、MS、MS-CTPP和AIPH@MS-CTPP的SEM圖像

i-l) AIPH@MS-CTPP中C、N、Si、O、Cl和P的元素映射圖、HADDF-STEM圖、線掃描輪廓和XPS光譜

m) 黑色素和MS的氮氣吸附-解吸等溫線

n) 黑色素、MS和AIPH@MS-CTPP的DLS分布圖

o) 黑色素、MS、MS-NH₂和AIPH@MS-CTPP納米顆粒的Zeta電位

圖2?AIPH@MS-CTPP的XPS和光熱轉換性能表征

a-f)?AIPH@MS-CTPP中Si 2p, O 1s, C 1s, N 1s, Cl 2p, P 2p的XPS譜

g) MS水溶液(1 mg·ml^-1)的紫外-可見光譜

h) 黑色素和MS (1 mg·ml^-1)的溫度曲線

i)不同濃度的MS在1064 nm激光照射下的溫度曲線

j,?k) MS隨輻照溫度變化8min，然后關閉激光的溫度變化曲線以及冷卻時間與負自然對數的關系圖

l) MS納米顆粒的循環加熱曲線

以上所用激光輻照功率均為1.0 W·cm^-2

圖3?體外聯合治療效果

a) PTT/TDT流程示意圖(AIPH@MS-CTPP)

b, c) AIPH@MS-CTPP溶液中POBN的ESR光譜以及ESR峰值隨輻照時間的變化曲線

d) CLSM圖像顯示AIPH@MS/Ce6和AIPH@MS-CTPP/Ce6孵育4 h后的亞細胞定位

e)不同濃度的黑色素、MS、MS-CTPP和AIPH@MS-CTPP在黑暗條件下處理4T1細胞的相對存活率

f)不同濃度的黑色素、MS、MS- CTPP或AIPH@MS-CTPP處理12 h后，1064 nm激光照射4T1細胞的相對存活率

g)不同分組4T1細胞自由基檢測(標尺為250 μm)

h)不同組calcein AM(綠色)和PI(紅色)染色的4T1細胞的CLSM成像

i)不同處理的4T1細胞凋亡檢測

以上使用照射激光:1064 nm, 1.0 W·cm^{- 2}, 5 min

圖4?不同納米顆粒的體內治療評價

a) 體內實驗的處理過程

b)1064 nm激光照射荷瘤小鼠的近紅外熱像圖

c)治療過程中4T1荷瘤小鼠的照片

d, e)第9天不同治療后的原發和遠端腫瘤的電子照片

f, g) 治療后小鼠原發和遠端腫瘤重量

h, i)各組小鼠第9天的原發腫瘤和遠端腫瘤相對體積曲線

j, k) Western blot和Caspase-3在原發和遠端腫瘤中不同處理的相對蛋白表達

l, m)原發和遠端腫瘤切片H&E和TUNEL染色圖像；比例尺= 50 μm

以上分組為 Ⅰ: PBS + α-PD-1 +激光、Ⅱ:黑色素+激光、Ⅲ:MS +激光、Ⅳ:AIPH@MS +激光、Ⅴ:AIPH@MS-CTPP +激光、Ⅵ:AIPH@MS-CTPP + α-PD-1 +激光。(1064 nm激光，1.0 W·cm^-2)?

圖5 小鼠體內免疫治療

a-c) ELISA檢測TNF-α，b) IFN-γ，c) IL-12蛋白的含量

d) 不同治療后遠端腫瘤中CD4⁺、CD8⁺T細胞浸潤及Foxp-3 Treg細胞、CD86、CD206的代表性免疫熒光圖像。比例尺:50 μm

以上分組為：Ⅰ: PBS + α-PD-1 +激光、Ⅱ: 黑色素+激光、Ⅲ: MS +激光、Ⅳ: AIPH@MS +激光、Ⅴ: AIPH@MS-CTPP +激光、Ⅵ: AIPH@MS-CTPP + α-PD-1 +激光。(1064 nm激光，1.0 W·cm^-2)

圖6 小鼠正常器官的H＆E染色

荷瘤4T1小鼠不同處理后臟器組織(心、肝、脾、肺、腎)的H&E染色(標尺:50 μm)。

以上分組為 Ⅰ: PBS + α-PD-1 +激光、Ⅱ: 黑色素+激光、Ⅲ: MS +激光、Ⅳ: AIPH@MS +激光、Ⅴ: AIPH@MS-CTPP +激光、Ⅵ: AIPH@MS-CTPP + α-PD-1 +激光?(1064 nm激光，1.0 W·cm^-2)

【小結】

本文通過提取直徑為100 nm左右的天然墨魚囊黑色素，后用大介孔SiO₂包被，CTPP修飾后負載AIPH，形成了AIPH@MS-CTPP納米顆粒。在1064 nm的激光照射下，AIPH@MS-CTPP納米顆粒表現出出色的光熱性質，產生熱量使AIPH熱分解產生烷基自由基，用于原位實體瘤的治療。將PTT、TDT與α-PD-1治療等多種治療手段聯合，通過體外激光照射，體內注射免疫檢查點阻斷劑的方式，來達到殺滅原位腫瘤，抑制遠端腫瘤的目的。此外，基于天然黑色素和介孔SiO₂都具有良好的生物安全性，因此我們得到的AIPH-MS@CTPP納米顆粒具有很好的臨床治療前景。

其他相關工作

(1) NIR-Driven Water Splitting H₂?Production Nanoplatform for H₂-Mediated Cascade-Amplifying Synergetic Cancer Therapy ?(ACS Appl. Mater. Interfaces 2020, 12, 23677-23688, DOI: 10.1021/acsami.0c03852)

(2) A Three-in-one ZIFs-Derived CuCo(O)/GOx@PCNs Hybrid Cascade?Nanozyme for Immunotherapy/Enhanced Starvation/Photothermal?Therapy (ACS Appl. Mater. Interfaces, 2021, 10.1021/acsami.1c01006)

(3) A multimodal strategy of Fe₃O₄@ZIF-8/GOx@MnO₂?hybrid nanozyme via TME modulation for tumor?therapy (Nanoscale, 2021, DOI: 10.1039/d1nr04196g)