Bioact. Mater. 西南交大魯雄/謝超鳴團隊制備具有活性氧清除、抗炎和免疫調節能力的多功能電活性支架

一、導讀

西南交通大學的魯雄教授、謝超鳴研究員團隊、四川大學的趙志河教授、王軍教授團隊合作在Bioactive materials上發表了一篇題為”Polydopamine-mediated graphene oxide and nanohydroxyapatite-incorporated conductive scaffold with an immunomodulatory ability accelerates periodontal bone regeneration in diabetes”的研究。團隊通過在海藻酸鈉/明膠網絡中引入多巴胺修飾的羥基磷灰石和氧化石墨烯納米顆粒，成功制備了具有良好力學性能、細胞相容性的電活性支架，并將其應用于糖尿病大鼠牙周骨缺損模型中。該支架通過電活性、活性氧清除能力、抗炎和免疫調節能力的協同效應，促進了糖尿病牙周炎癥微環境中的牙槽骨缺損再生，為設計免疫調節生物材料治療免疫相關疾病和組織再生提供了一種新的策略

論文通訊作者是魯雄、謝超鳴、趙志河、王軍；第一作者是李亞禎。

二、內容簡介

牙周炎是一種常見的慢性炎癥性疾病，可導致牙周組織破壞，主要包括牙齦萎縮和牙槽骨缺損。尤其在糖尿病條件下，高水平的血糖水平會觸發激活免疫細胞趨化因子的產生。長期炎癥狀態會誘導活性氧的產生，從而導致局部牙周微環境中炎癥因子的過度表達。此外，糖尿病與M1型巨噬細胞的長時間極化有關，后者可誘導慢性炎癥，糖尿病患者的免疫反應加劇了牙周炎的病程進展。因此，在糖尿病條件下的牙周骨缺損修復再生是一個巨大的挑戰。

針對在糖尿病條件下牙周骨組織修復困難的問題，近日，西南交通大學的魯雄教授、謝超鳴研究員團隊、四川大學的趙志河教授、王軍教授團隊合作研發了一種包含聚多巴胺（PDA）還原氧化石墨烯（PGO）和PDA修飾羥基磷灰石納米顆粒（PHA）的仿貽貝多功能電活性海藻酸鹽/明膠（AG）支架，以調節糖尿病炎癥微環境，促進牙周骨缺損再生。PDA的特性使PHA和PGO能夠很好地分散在AG網絡中。通過PDA的功能化，PGO表現出比GO更好的導電性能。支架中的PGO提供了一條導電通路，使支架具有電活性。通過電活性，支架將內源性電信號傳遞給細胞，從而激活細胞表面的鈣離子通道。此外，PDA功能化可以賦予材料免疫調節能力。PDA對細胞的粘附能力和ROS清除特性協同賦予支架免疫調節能力，即降低巨噬細胞的M1向極化以下調炎性因子的表達，并促進巨噬細胞極化為M2型。最終PGO-PHA-AG復合支架的電活性和免疫調節能力協同促進糖尿病牙周炎癥微環境中的牙槽骨缺損再生（圖1）。

圖1 用于糖尿病牙周骨缺損再生的具有多功能特性的PGO-PHA-AG支架合成示意圖。（a）PHA合成示意圖。（b）PGO合成示意圖。（c）物理化學雙交聯PGO-PHA-AG支架網絡中的相互作用方式。（d）糖尿病牙周微環境中ROS、M1型巨噬細胞和炎性因子過度表達。（e）該支架促進細胞粘附，將內源性電信號傳遞給細胞，進而激活鈣離子通道。（f）PDA的細胞粘附能力和ROS清除能力賦予支架免疫調節能力，降低巨噬細胞向M1型方向極化，促進巨噬細胞向M2型巨噬細胞方向極化并分泌成骨相關細胞因子。（g）支架的電活性和免疫調節能力協同促進糖尿病牙周骨缺損再生。

1、支架具有良好的導電性能、力學性能、回復性、吸液能力。PDA功能化可加強PGO的導電性，PGO為支架提供了導電通路，使支架具有良好的導電性能。PHA和PGO納米顆粒的納米增強效應增加了支架的壓縮強度。PGO的親水性為支架帶來優異的吸液能力（圖2）。

圖2?PGO、PHA、PGO-PHA-AG支架的表征。（a）PGO的TEM圖像。（b）GO、rGO、PGO分散于去離子水中60分鐘后的圖像。（c）PHA的TEM和（d）高分辨TEM圖像。（e）PHA表現出典型的丁達爾效應。（f, g）PGO-PHA-AG支架的SEM圖像。（h）PGO-PHA-AG支架的EDS元素mapping圖像。（i）PGO-PHA-AG支架接入電路并點亮發光二極管（LED）。（j）不同PGO含量的支架的電導率。（k）壓縮PGO-PHA-AG支架后的電導率（0, 25, 50, 75%）。（l）AG支架、PHA-AG支架、PGO-PHA-AG支架的壓縮強度。（m）對帶有發光二極管的PGO-PHA-AG支架進行壓縮，壓縮應力去除后回復到初始形狀。（n）將PGO-PHA-AG支架置于含羅丹明的去離子水中3秒。（o）AG、PHA-AG、PGO-PHA-AG支架的吸液能力。

2、支架具有良好的電活性、活性氧清除能力和免疫調節能力。PGO-PHA-AG電活性支架是一個有前景的促干細胞成骨分化平臺。PHA為支架提供骨誘導能力，PGO為支架提供導電通路。電刺激和PGO-PHA-AG支架協同促進BMSCs的成骨分化。PGO-PHA-AG支架將電信號傳遞給BMSCs，激活BMSCs表面的Ca²⁺通道，細胞內的Ca²⁺濃度增加，進而促進BMSCs的成骨分化（圖3）。由于支架表面豐富的鄰苯二酚基團和氧化還原性能，其可有效保護細胞免受過量ROS的損害（圖4）。支架的細胞粘附能力和ROS清除能力使其可調節局部免疫炎癥微環境，減少M1型巨噬細胞，增加M2型巨噬細胞極化并分泌促成骨相關細胞因子（圖5和6）。

圖3 支架表面的BMSCs的粘附和高通量電刺激。（a）BMSCs在AG、PHA-AG和PGO-PHA-AG支架表面的細胞形態。（b）BMSCs的細胞鋪展面積。（c）培養3和7天后，BMSCs在不同支架上的增殖活性。（d）高通量電刺激的示意圖。電活性支架向BMSCs傳遞電信號，導致Ca²⁺內流，最終促進BMSCs成骨分化。（e）在不同電壓刺激下，14天后不同支架上的BMSCs堿性磷酸酶（ALP）活性。（f–h）培養14天后，有無電刺激對不同支架上的成骨相關基因表達的影響，包括I型膠原（COL1A1）、成骨細胞特異性轉錄因子（Osx）、堿性磷酸酶（ALP）。（i）通過流式細胞術檢測異硫氰酸熒光素（FITC）通道中Fluo-4 探針標記的細胞，檢測電刺激對PGO-PHA-AG支架上細胞內的Ca²⁺濃度的影響。

圖4?PGO-PHA-AG支架的體外抗氧化性能。（a）PGO-PHA-AG支架的抗氧化能力的機制。（b）PGO-PHA-AG支架的循環伏安（CV）曲線。（c）不同支架清除DPPH自由基的效率。（d）不同支架清除細胞內ROS的性能。（e）通過流式細胞術檢測FITC通道中DCFH-DA標記的細胞。

圖5?PGO-PHA-AG支架對巨噬細胞的免疫調節能力。（a）和不同支架培養的巨噬細胞的誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、CD163、細胞核的免疫熒光染色。（b）iNOS和CD163的免疫蛋白印跡分析。（c）通過流式細胞術檢測CD86（M1型巨噬細胞）和CD206（M2型巨噬細胞）的表達來評估巨噬細胞的極化情況。（d）M1巨噬細胞相關基因表達，包括白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）和iNOS。（e）M2巨噬細胞相關基因表達，包括CD206、CD163和精氨酸酶1（Arg1）。（f）巨噬細胞分泌的成骨相關基因，包括骨形態發生蛋白-2（BMP-2）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）。（g, h）巨噬細胞條件培養液培養7天后BMSCs的ALP染色和ALP活性定量分析。（i）在巨噬細胞條件培養液中培養7天后，BMSCs的成骨相關基因表達，包括ALP、COL1A1和Runx2。（j, k）巨噬細胞條件培養液培養14天后BMSCs的ARS染色和定量分析。

圖6 PGO-PHA-AG支架誘導巨噬細胞極化的機制探究。（a）在AG和PGO-PHA-AG支架上培養的巨噬細胞的基因本體分析。BP：生物過程；CC：細胞成分；MF：分子功能。（b）AG與PGO-PHA-AG組的KEGG通路富集分析。（c）對涉及HIF-1信號通路、糖酵解通路、促炎細胞因子、細胞粘附分子、細胞骨架排列和機械傳導的差異表達基因進行熱圖分析。（d）PGO-PHA-AG支架上巨噬細胞極化機制示意圖。

圖7?大鼠體內糖尿病牙周骨缺損修復。（a）支架植入糖尿病大鼠牙周骨缺損模型。（b）大鼠下頜骨植入部位的Micro-CT圖像。（c）四組的骨密度（BMD）比較。（d）四組的骨體積與總體積的比率（BV/TV）比較。（e, f）植入后28天缺損區域的H&E和Masson染色。FT: 纖維組織；NB: 新骨；MB: 成熟骨。（g–l）植入后14天牙周缺損區域8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）、4-羥基壬烯醛（4-HNE）和白細胞介素-6（IL-6）（紅色）的免疫熒光染色和均一化熒光強度。

圖8?缺損區域的免疫熒光染色。（a–d）缺損區域iNOS和CD206（紅色）的免疫熒光染色，以及均一化熒光強度。（e–h）牙周缺損區域骨鈣素（OCN）和Runt相關轉錄因子2（Runx2）（綠色）的免疫熒光染色，以及均一化熒光強度。

三、總結和展望

綜上所述，基于支架良好的電活性、抗氧化活性、抗炎能力、免疫調節能力協同作用，該支架可加速糖尿病炎癥條件下的牙周骨組織修復再生（圖7和8），為設計免疫調節生物材料治療免疫相關疾病和組織再生提供了一種新的策略。

論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X22001384

本文由作者供稿。