南京大學蔣錫群Nature Biomedical Engineering：腫瘤成像光學探針領域新進展！

【引言】

腫瘤的早期診斷是一個重要的挑戰，腫瘤組織具有不同于正常組織的特異性微環境，對腫瘤特異性微環境的成像對于研究腫瘤發生與發展的機理以及腫瘤的診斷有著極其重要的意義。對腫瘤標志物特異性響應的光學探針可以將腫瘤標志性特征的表達水平轉換為光學信號的形式表現出來，從而直觀地實現了對腫瘤微環境的定性或定量化研究。然而，由于許多腫瘤標志物的表達水平在腫瘤組織和正常組織中差異并不大，且相應光學探針的靈敏度有限，因而往往難以實現對腫瘤微環境的高特異性和信噪比的光學成像。

【成果簡介】

南京大學蔣錫群（通訊作者）團隊在解決腫瘤高特異性光學成像這一難題方面取得重要進展，并于北京時間2017年4月10日在Nature Biomedical Engineering上發表——題為“Successively activatable ultrasensitive probe for imaging tumour acidity and hypoxia”，論文第一作者是鄭先創博士。該成果的亮點在于提出了一種連續放大腫瘤微環境信號的策略，創制了一種對酸化和乏氧連續響應的大分子光學探針。和傳統的開關（turn on/off）探針設計原則不同，該工作以病灶生物環境變化引起的探針信號波長的移動來實現探針信號的放大。同時，探針信號波長的移動又被進一步利用來反映病灶的生物學事件和參數。例如，這種探針在正常組織中發射出較弱的紅色熒光，而在進入實體腫瘤之后，探針會首先對腫瘤的微酸性微環境進行響應，并轉換成一種具有近紅外熒光發射的報告分子，接著，該報告分子還能進一步對腫瘤的低氧微環境進行響應，伴隨著其近紅外熒光發射強度的增強（圖1）。通過上述波長移動/熒光強度增強的連續響應，可以有效地實現對腫瘤微環境信號的兩步放大。小鼠腫瘤模型的測試結果顯示，這種兩步連續響應的大分子光學探針在腫瘤成像中表現出了高于常規一步響應的光學探針一個數量級以上的信噪比。在小鼠腫瘤肝臟轉移模型中，該探針能夠高靈敏地檢測到1毫米大小的微小腫瘤轉移灶。這一研究工作為新型腫瘤微環境的光學成像，成像引導的腫瘤手術以及腫瘤治療效果的評估等提供了新的工具。該探針同時也為疾病機理，細胞生物學和系統生物學的基礎研究提供了一個功能成像的靶向探針。

【圖文導讀】

圖1.探針的雙刺激信號放大過程的原理及其光物理性質

a.探針進入腫瘤后的響應行為。當血管從血管滲出，進入腫瘤酸性的細胞外環境后，探針分子將被轉換成報告分子，并伴隨著熒光發射峰紅移到近紅外區域。隨后，當報告分子暴露于乏氧微環境下時，報告分子的近紅外發射又被進一步增強，從而形成對腫瘤微環境兩步響應和放大。b、c.探針報告分子（b）和（c）兩種狀態的三維熒光光譜圖。d.探針分子的血清穩定性測試表明：在610nm和705nm處24h以后還有強烈的發射演變。e.pH=5.5-7.4范圍內探針的發射光譜，激發:450nm。f.探針報告分子在不同氧濃度下的發射光譜，激發：580nm。g. 報告分子位于705 nm 發射峰強度隨氧分壓降低而升高的曲線，激發：580 nm。

圖2.探針對于細胞內酸性和氧濃度的響應以及腫瘤切片的免疫染色

a.細胞與探針分子(0.01 mM) 在不同pH 值 (6.0, 6.8, 7.4) 下共培養 2 h 后的激光共聚焦圖片。圖中所示的610 nm 信號對應于458 nm 激光器激發并在580-630 nm 區間檢測，而705 nm 信號對應于543 nm 激光器激發并在680-730 nm 區間檢測。pH 響應測試在同一氧分壓（0%）下測試。b.pH 7.4 條件下，報告分子信號 (680-730 nm 通道) 與溶酶體染色劑 LysoTracker 信號在HeLa 細胞內的共定位情況。c.在pH=7.4和6.8時，探針分子和探針報告分子轉換的機理。d.?在pH 6.0 條件下，HeLa 細胞與探針分子 (0.01 mM) 在不同氧分壓下 (21, 10 , 5, 2.5 and 0%)共培養后的激光共聚焦圖片。使用543 nm 激光器激發，信號在 680-730 nm 區間收集。e. 說明癌細胞兩種代謝途徑以及其之間相互聯系的示意圖。f.?H22 腫瘤冰凍切片免疫熒光染色圖片，HIF-1α 與LDH-A 共染。g.?H22 腫瘤冰凍切片免疫熒光染色圖片，哌莫硝唑 (PIMO) 與 MCT-4 共染。

圖3.小鼠移植瘤模型的光學成像

a.右側大腿負荷H22 腫瘤的ICR 小鼠通過尾靜脈注射探針分子 (40 mg kg-1)后不同時間點的活體成像圖。成像信號采集波長范圍為670-800 nm，激發：595 nm。b.探針注射96 h 后的腫瘤和主要器官成像圖片。c. 靜脈注射探針后不同時間點，探針在腫瘤，血液或主要器官中的分布情況(n = 5)。d. 腫瘤和主要器官中歸一化信號強度比較。歸一化強度由不同器官上單位面積的信號強度除以該器官中Ir 配合物的體內分布濃度得到(n=5)。**P<0.01,使用ANOVA 方法比較。e. 探針報告分子注射48h 后的腫瘤和主要器官成像圖片。f.腫瘤和主要器官中歸一化信號強度比較,注射探針報告分子48h后。**P<0.01,使用ANOVA 方法比較。g.探針在活體中對于不同pH和氧濃度的響應,通過兩個通道對小鼠進行成像，610nm檢測探針分子以及705nm檢測探針報告分子。

圖4.轉移性肝損傷以及原位肝癌腫瘤的檢測

a．荷有MDA-MB-231乳腺癌腫瘤的小鼠注射探針分子后的全身成像，劑量：48mg/kg。b. 探針前體注射48 h 后的腫瘤和主要器官成像圖片。c.放大之后的強反差的黑白圖像凸顯出轉移瘤結節，基準尺1cm。d.解剖后肝臟的照片，肉眼可見轉移瘤結節。e-g.ROI 1(e),ROI 2(f)和ROI 3(g)區域放大的強光和近紅外圖像,g圖中箭頭所指兩個瘤塊無法肉眼可見。h.三個ROI區域以及周圍正常肝臟組織的信號強度，誤差平均值± s.d. (n = 12). **P < 0.01, 使用 Student’s t-test比較方法。i，j：組織切片的免疫染色，左：H&E染色，右：抗體染色針對哌莫硝唑 (i) 與 MCT-4（j），紅線表示腫瘤和正常組織的邊界，基準尺：100um。k.注射探針24h后，荷有HCCLMS-Luc腫瘤裸鼠的全身生物發光成像以及近紅外成像，注射劑量：40mg/kg。l.?注射探針24h后，解剖出的肝臟的生物發光成像以及近紅外成像圖，基準尺：5mm

圖5.探針對于藥物引起的胞內酸化率和耗氧率改變的響應

a．Oxamate, c.?2-DG 對細胞內探針信號的影響，藥物處理過的4T1 細胞 (106) 和未經藥物處理的 4T1 細胞 (106) 加入相同數量的探針分子后，分別被注射到小鼠的右側和左側大腿處，成像后，比較兩邊細胞產生的信號強度差異 (n=5)。**P<0.01，*P<0.05，使用Student’s t-test 方法。b,d.?測量4T1 細胞的氧消耗速率(OCR) 和細胞外酸化速率 (ECAR)。在20 min 測試時間點加入藥物，來考察它們對氧消耗和細胞外酸化速率的影響 (n=8)。所用藥物為：b. Oxamate, d .2-DG。e-l.同上方法，所用藥物換成 FCCP, ryanodine，Oligomycin, rotenone，測試藥物對細胞內探針信號以及細胞的ECAR 和OCR 的影響。

【小結】

該團隊設計了一種對于腫瘤微環境酸化和乏氧連續響應的大分子光學探針，具有高信噪比，能檢測到小于1mm的微小腫瘤病灶，這一研究工作為新型腫瘤微環境的光學成像，成像引導的腫瘤手術以及腫瘤治療效果的評估等提供了新的工具。

文獻鏈接：Successively activatable ultrasensitive probe for imaging tumour acidity and hypoxia（Nature Biomedical Engineering , 2017，doi:10.1038/s41551-017-0057）

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