食品安全檢測新材料︱上轉換發光材料

基于熒光共振能量轉移的上轉換NaYF4:Yb,Er傳感器檢測葡萄糖

上轉換發光技術又稱UPT（upconverting technology），是基于上轉換發光納米顆粒（upconverting nanoparticles，UCNPs）的一種新興技術，其本質為反斯托克斯發光。由斯托克斯定律而來，斯托克斯定律認為材料只能受到高能量的光激發，而發出低能量的光，換句話說，就是波長短、頻率高的光激發出波長長、頻率低的光。但是后來人們發現，有些材料可以實現與上述定律正好相反的發光效果，即可以將低能量的紅外輻射變為高能量的近紅外輻射或可見光輻射。于是我們稱其為反斯托克斯發光，又稱上轉換發光。因其獨特的光學和化學特性而備受國內外專家學者的關注。

UCNPs即上轉換發光納米顆粒，主要是指摻雜了稀土元素的固體化合物，可以通過吸收兩個或多個（長波長）低能光子而發射出一個（短波長）高能光子，是一個非線性的光學過程，其在近紅外光源的激發下，可以發射出短波長的光，其范圍可從紫外光到近紅外光。UCNPs通常由基質材料、激活劑、敏化劑組成。利用稀土元素離子亞穩態的能級在光激發過程中發生反斯托克斯效應。

UCNPs之所以會受到國內外專家學者的青睞是因為其具有如下其他物質所不可替代的優勢：首先，UCNPs有非常好的光學特性。這使得其能夠在光學生物成像中有多種顯著的特點，如極弱的背景熒光、大的反斯托克斯效應，窄的發射帶寬、不易光漂白、熒光穩定、更少的光散射和更深的組織穿透力。尤其是這些納米粒子的熒光穩定且不閃爍特點，使得其能夠更好地應用于體內或體外的跟蹤治療。其與生物體內細胞熒光素重疊的光譜被減到最低，這使得在細胞成像中存在了零背景熒光干擾。因此，這種發射可見光（藍、綠、紅）的UCNPs已經被用于細胞多色成像、淺組織成像和透射生物體。UCNPs是由近紅外光激發的，又可以發射近紅外光，因此，其在體內成像時可以有較少的光散射和較深的組織穿透能力。

熒光成像技術是通過光激發熒光探針進行成像，相比于其他技術具有價格低廉、分辨率高、靈敏快速的優點。有機染料和熒光蛋白是最早使用也是最常使用的生物發光探針，其量子產率高，粒徑小，生物相容性好，易于表面修飾，相對于其他熒光探針有著天然優勢，但其穩定性差、斯托克斯位移小、發射峰寬、容易被光漂白等缺點極大地限制了其應用，而UCNPs能夠很好地克服上述生物發光探針在成像中的不足；隨后發展的半導體熒光納米晶體和無機量子點的光穩定性好，發射峰窄且峰位置可控，克服了傳統有機熒光染料的部分缺點，擴寬了熒光探針的應用范圍，然而也存在間歇性熒光發射（“光閃爍”現象）和潛在的生物毒性等局限。上述傳統的生物標記材料（有機染料、熒光蛋白、半導體納米晶體、無機量子點等）多使用短波長的紫外光或可見光作為激發光源，因此在應用于生物組織過程中存在普遍問題：①短波長激發光對生物組織的穿透性差；②長時間照射引起的組織損傷和細胞死亡；③生物組織在短波激發下有自發熒光產生背景噪音干擾成像結果。因此研發出能克服傳統生物標記探針缺點，更為有效的新型熒光材料尤為重要。顯然，UCNPs能很好地克服傳統材料的不足。

第二，UCNPs有非常好的化學特性，可以很好地結合治療因子。單分子的UCNPs顆粒形狀、大小可控且具有較大的比表面積，故而可以很好地結合藥物或目標配體。UCNPs與載體既可以由非共價鍵進行偶聯也可以由共價鍵進行偶聯。此外，其納米粒子表面可以進行調整來使其有多種配位功能，由此可以提供一個有效的藥物輸送系統以確保細胞攝取和載體釋放和目標細胞定位。

最后，UCNPs也有著很好的生物相容性，因為其不包含有毒的化學元素，這使得其具有潛在的生物醫學應用價值且在生物傳感和活體成像方面的作用也已經被描述出來。

上轉換發光材料的合成機理

在過去的幾年中，人們對上轉換材料的發光機制已經有了深入研究。上轉換過程是由低能量的電子激發而產生高能量發射的非線性過程，由于過程為雙光子或多光子過程，違背斯托克斯定律，因而也稱為反斯托克斯過程。其機制可分為三大類：激發態吸收（excited state absorption，ESA）、能量轉移（energy transfer，ET）和光子雪崩（photon avalanche，PA）。下圖為幾種上轉換發光過程示意圖。

上轉換發光機制示意圖

激發態吸收：即為同一離子吸收兩個光子，是唯一一種發生在低濃度稀土摻雜材料中的過程。第一個光子使離子從基態進入到一個穩定的中間激發態（即基態吸收，GSA），第二個光子將離子從中間態激勵至更高的激發態,最后激發離子回落基態而產生上轉換發光。也存在稀土離子一次性吸收兩個光子的雙光子激發過程（TPAE）。

能量轉移：發生在有敏化劑摻雜的材料中，敏化劑被激發后回落至基態，能量轉移給鄰近的激活劑離子。能量吸收過程通常發生在高濃度稀土離子摻雜的材料中，且可與激發態吸收同時存在，可分為能量轉移伴隨激發態吸收（EFE）、連續能量轉移（APTE）、交叉弛豫（CR）、合作上轉換發光（COL）、合作敏化（COS）等常見類型。

光子雪崩（PA）：也成為吸收雪崩，是產生發光效率最高的機制。首先敏化離子吸收光躍遷至第一激發態，而后再次吸收入射光子躍遷至第二激發態。處于第二激發態的敏化離子可以與鄰近的基態離子發生交叉弛豫產生兩個處于第一激發態的敏化離子，這兩個敏化離子又可以再次吸收光子重復此過程產生四個激發態敏化離子，由此如雪崩般積累產生大量處于中間激發態的敏化離子而儲存大量能量。

上轉換發光材料的合成方法

上轉換材料中的敏化劑離子和發光中心——激活劑的成分和摻雜比例對材料的發光效率起到了決定性的影響，大多數上轉換材料中敏化劑的摻雜量大約為20%（摩爾分數），而激發劑小于2%（摩爾分數）。摻雜的稀土離子Ho³⁺、Nd³⁺、Tm³⁺、Er³⁺等擁有豐富的能級，由于受4f能級外層的電子屏蔽作用，能級壽命較長。稀土離子Yb³⁺的激發波長是980nm，與Er³⁺第一激發態的吸收能量一致，且吸收截面遠大于Er³⁺，因而是一種很有效的敏化劑。無機化合物基體為激活離子提供適合的晶體場，且需要對入射光基本無吸收，聲子能量低以便最大限度降低非輻射損失，提高稀土離子上轉換過程的效率。在諸多材料中，氟化物由于其低的光子能量和高的化學穩定性，是最為理想的基體材料。如Yb³⁺/Er³⁺和Yb³⁺/Tm³⁺摻雜的NaYF₄是最高效的產生藍色和綠色發光的材料。NaYF₄在常壓下有兩種結晶態，α相-立方晶系和β相-六方晶系，β-NaYF₄為基體的材料發光效率遠高于α-NaYF₄的材料，所以對基體晶型的控制也是必不可少的合成環節。

上轉換納米粒子不同于量子點，其能級的轉化主要定域于敏化劑和激活劑之間，通過偶極或者其他相互作用改變傳遞能量，不顯示量子定域效應，故不需要像合成量子點時一樣對粒徑進行嚴格掌控。而反應物的均一分散和比例優化、對稀土元素氧化態的控制是制備過程中的重點。激光蝕刻法和消解法可以從塊體材料得到相應的納米顆粒，但是很難實現對粒徑和分散性的掌控。相對于上述物理法，化學法是更好的合成路徑，如共沉淀法、溶膠凝膠法、熱分解法、水熱合成法等。

共沉淀法

合成條件溫和，設備易得，易于操作，是合成上轉換材料最簡單且方便的方法。合成的上轉換納米顆粒粒徑分布均勻且粒徑可控。Yi等首先提出了在EDTA輔助共沉淀法合成NaYF₄:Yb,Er，方法為將稀土離子-EDTA復合物迅速加入NaF溶液中并劇烈攪拌。通過均相成核過程生成了α相的NaYF4:Yb,Er納米顆粒，通過改變EDTA和稀土元素的比例可將粒徑控制在37～166nm。由于α相的納米顆粒上轉換發射太弱，需要退火使α相NaYF₄轉變為β相，上轉換熒光可增強40倍左右。共沉淀法的缺點是產物結晶程度低。

溶膠-凝膠法

溶膠-凝膠法是制備溶液前驅體，經過溶膠進而轉變為凝膠，而后經焙燒熱處理取出有機成分，這種方法難以控制納米顆粒的形狀和粒徑，所以難以達到單分散的納米顆粒，而且產物經常會摻雜炭顆粒污染物。另外溶膠-凝膠法還能用于合成氧化和氫氧化納米材料。經過改進的溶膠-凝膠法可通過使用金屬醋酸鹽三氟乙酸制備摻雜Eu³⁺離子的CaF₂納米顆粒，首先將Ca(OH)₂和Eu(CH₃COO)₃·4H₂O溶解于去離子水和乙醇混合物中，用三氟乙酸超聲1h,得到的沉淀在100℃干燥24h并高溫陳化，將溫度升高至700℃調整實現使粒徑從15～200nm的增加。

熱分解法

熱分解法的原理是金屬四氟醋酸鹽可熱分解形成相應的金屬氟化物。因此熱分解反應步驟為：將溶劑和金屬四氟醋酸鹽置于三頸瓶中，劇烈攪拌后加熱至100℃除去水和氧氣得到透明溶液，繼續在氬氣的環境中加熱到250～330℃。將過量的乙醇導入溶液中，沉淀物經過離心與液相分離，洗滌后烘干即可得到目標產物。近些年來熱分解法經過不斷完善，改變反應物類型、比例，使用新型溶劑和優化加熱程序，可得到滿意的上轉換納米材料。盡管熱分解法被證實為一種有效的合成單分散、結晶度高、粒徑均一和純凈的上轉換納米顆粒的方法，但是仍有一些不足，諸如合成條件苛刻、時間長、溫度高，合成過程中會產生有毒物質等。

水熱合成法

水熱反應指在密閉的高溫高壓環境中進行的合成步驟，基于反應原料在高溫高壓下在水中的高溶解度，使溶解在液相中的物質形成結晶，反應過程不需要使用毒性高的有機溶劑，相對于熱分解法更加綠色友好。典型的水熱反應是在一種特制的反應容器——反應釜中進行的。Song等設計的水熱反應合成步驟如下：將總量為0.5mmol的稀土氧化物（0.325mmolY₂O₃+0.075mmolGd₂O₃+0.09mmolYb₂O₃+0.01mmolEr₂O₃）溶解于10mL、10%的鹽酸溶液中，而后將溶液蒸干得到稀土氯化物粉末，然后加入含有0.5g PVP的10mL乙二醇將粉末溶解，機械攪拌呈均一溶液。再快速加入16mL含有0.302gNaF的乙二醇溶液，攪拌10min后轉移至30mL水熱反應釜中于220℃密閉充分反應，冷卻至室溫，離心機收集沉淀用去離子水和乙醇洗滌，最后用真空干燥箱干燥24h。此方法合成了粒徑為40～100nm的NaYF₄:Yb,Er納米顆粒，優化反應時間和配比可得到親水性強、發光效率高的優良上轉換熒光材料。

水熱反應合成高質量的上轉換納米顆粒有以下優勢：①產物十分純凈；②容易控制顆粒的粒徑結構和形態；③相對低的反應溫度；④操作過程使用設備簡單。但由于水熱合成法的限制在于生成的納米顆粒表面大多都存在疏水基團，所以需要后續的修飾增加水溶性。

其他方法

SK Singh等報道了一種水相的脈沖激光蝕刻法，合成納米球的形狀尺寸可控，不用加入任何表面活性劑即可溶解形成透明溶液。這種激光蝕刻法的優勢在于可以得到粒徑分布均勻、孔隙率低、雜質少晶格缺陷率低、化學成分復雜的上轉換納米材料。首先用溶液燃燒法合成Er³⁺、Yb³⁺摻雜的Gd₂O₃熒光團，將合成的塊體熒光團浸沒于溶液中，用頻率10Hz的第三諧振（355nm）的脈沖輻射，在輻射過程中不斷翻轉以避免在塊體表面形成孔洞，并不斷攪動溶液防止自吸效應。該方法合成了粒徑在8～26nm的納米球，并在溶液中形成透明分散的溶膠，溶膠顯示出多種顏色的可見上轉換熒光，可以用于生物成像和標記。另外還有微乳法、固體模板法等。

目前，UCNPs在合成、修飾和應用方面取得了突飛猛進的發展，特有的光學特性及高度的可調性使得這些材料成為了誘導成像、藥物傳送、靶向應用和生物傳感等領域中具有很大潛力的材料。雖然取得了很大的進步，但是依然存在很多問題有待我們解決。例如，①我們使用的一些UCNPs在980nm的吸收峰與水的吸收峰是重疊的，這就造成了不利于進行成像研究的熱效應。因此，這就需要研究一種新的發射波長在700～900nm的UCNPs。②關于活體成像和藥物傳送中，要想利用一個有效的尿排泄來把體內的納米顆粒移除到體外，需要把納米顆粒的尺寸控制在6nm之內。然而，縮小UCNPs的尺寸后，往往導致其發光效率變低，因為其表面的熒光猝滅效應是由尺寸決定的。因此，單分散性的小尺寸納米結構且發射強熒光的UCNPs的新的設計及合成方法也是需要研究的。③一般的顯微鏡和活體成像系統需要被個性化制作來使其適應UCNPs特有的激發和發射特性。因此，商業設備及系統的發展對加快UCNPs的應用有至關重要的作用。

況且，系統的研究成像方法和藥物傳送理論特性，如吸收率、釋放率和毒性，將會為這些納米顆粒在體內的最優化應用提供較為深刻的分析基礎。同樣重要的是，這些研究將會為解釋細胞對納米顆粒的吸收機制提供較為深刻的理論基礎。最后，靶標傳送方法的創建很大程度上提高了我們對靈敏性疾病，如癌癥和HIV的治療水平。

另外上轉換材料已在疾病檢測等方面取得巨大成功,但在檢測食品中農藥、獸藥殘留方面研究尚少。將上轉換技術與酶聯免疫技術、膠體金技術聯合起來，實現對目標物的快速靈敏檢測，在食品安全與衛生、醫學檢測等方面有重大的意義。

本文由安靜摘編自高志賢主編《食品安全快速檢測新技術及新材料》之第十章。

《食品安全快速檢測新技術及新材料》論述了食品安全快速檢測的新技術以及新型材料在食品安全檢測中的應用。其中，食品安全檢測技術包括電化學、電化學發光技術、石英晶體微天平、表面等離子體共振、量熱傳感技術、懸浮芯片、核酸適配體技術等技術原理及其在食品安全檢測中的應用；新材料包括磁性納米材料、量子點及上轉換發光材料與光子晶體材料的合成技術及其在食品安全中的應用研究。

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