ACS Nano：通過ZnO/PDA/RGDC納米棒的選擇性物理穿刺和生物功能化平衡細菌-成骨細胞競爭

【引言】

骨科手術后有量大并發癥，即感染和不充分的骨整合，并因此導致種植體松動、骨折畸形愈合或不愈合以及植入失敗。感染通常是由于種植體表面細菌粘附和生物膜形成。由于能夠抵抗宿主防御和抗生素，一個成熟的細菌生物膜可以使基于系統性抗生素的傳統治療方法無效。在嚴重的情況下，需要二次手術移去植入物。這不僅增加患者創傷也提高了費用。因此，有必要使人工植入材料具有有效的自我抗菌能力。目前多種方法被應用于此，包括抗菌結構、抗菌肽、銀納米顆粒等技術。然而，當抗菌劑加入以提高抗菌性的時候，骨誘導性往往降低而毒性上升。因此，關鍵是在抑制細菌的同時，允許足夠的成骨細胞生長，也就是平衡細菌和成骨細胞之間的競爭。細胞和細菌的粘附可以通過不同結構的表面形貌來調節。由于成骨細胞的大小比細菌大一個數量級，成骨細胞和細菌對納米棒陣列的敏感性有很大的差別。生物材料與適當的鋅結合，可促進體外和體內的初始細胞粘附、鋪展、增殖、成骨分化、骨形成和礦化。雖然納米氧化鋅具有良好的抗菌活性，但由于大量的Zn2+對細胞生長和組織形成產生不利影響，活性氧（ROS）可誘導細胞凋亡，因此具有明顯的細胞毒作用。因此，控制鋅離子的釋放和納米氧化鋅的生成是平衡抗菌活性和細胞毒性的關鍵。聚多巴胺（PDA）具有良好的生物相容性、生物降解性、親水性。此外，PDA具有較強的抗氧化作用，可清除反應性自由基。PDA與胺和/或含硫醇分子之間的反應有利于生物活性分子的接枝。類似的精氨酸甘氨酸-天冬氨酸（RGD）、RGD cysteine（RGDC）是提高許多類型的細胞附著到不同的基板，可以有效激活細胞整合素的粘附受體，因此，對肽共價結合是一個可行的策略來提高細胞的粘附和增殖的成骨性能的提高。

【成果簡介】

近日，湖北大學、天津大學、香港城市大學以及香港大學的科研團隊合作設計了氧化鋅/聚多巴胺（PDA）/精氨酸甘氨酸天冬氨酸半胱氨酸-半胱氨酸（RGDC）納米棒（NR）陣列并將其用于鈦（Ti）植入物，不僅提高了骨誘導性同時還能有效殺死細菌。這都歸因于在細菌與成骨細胞之間競爭中，ZnO/ PDA /RGDC納米棒的選擇性物理穿刺和生物功能化。由于成骨細胞的尺寸比細菌大得多，復合納米棒可以穿刺細菌而不損傷成骨細胞。同時，通過抑制活性氧和高鋅離子濃度，覆蓋的PDA和RGDC提高了細胞相容性。體外實驗證實了細菌膜的選擇性穿刺和更好的成骨活性。體內試驗也通過周圍組織中更少的中性粒細胞分葉和細菌粘附顯示出更高的抗菌效果。此外，即使在注射了細菌的情況下，復合納米棒也加快了新骨組織形成（比純鈦高20.1%）以及植入物和與新形成組織的骨整合（比純鈦高32%）。相關成果以題為“Balancing Bacteria?Osteoblast Competition through Selective Physical Puncture and Biofunctionalization of ZnO/Polydopamine/ Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Cysteine Nanorods ”發表在了ACS Nano上。論文的通訊作者為吳水林教授。

【圖文導讀】

示意圖1 通過ZnO/PDA/RGDC混合納米棒陣列平衡種鈦植體表面細菌-成骨細胞競爭的示意圖

圖1 材料的制備與表征1

(A)制備鈦表面混合ZnO/PDA/RGDC納米陣列的示意圖；

FE-SEM圖(B) Ti- ZnOs (比例尺=100 nm)，(C) Ti-ZnO, (D)Ti-ZnO/PDA, (E) Ti-ZnO/PDA/RGDC；

(E1) Ti-ZnO/PDA/ RGDC 橫斷面；

(E2) Ti-ZnO/PDA/ RGDC元素映射 (比例尺=100 nm(插入圖=1 μm))

圖2 材料的制備與表征2

(A) Ti, Ti-ZnOs, Ti-ZnO, Ti-ZnO/PDA和Ti-ZnO/PDA/RGDC的XRD分析；

(B) Ti-ZnO/PDA 和Ti- ZnO/PDA/RGDC的傅里葉分析；

(C) Ti-ZnO, Ti-ZnO/PDA, 和Ti-ZnO/PDA/RGDC的XPS分析；

(C1) Ti-ZnO/PDA峰 (C2) Ti-ZnO/PDA/RGDC峰;

(D) Ti, Ti-ZnOs, Ti-ZnO, Ti-ZnO/PDA, 和Ti-ZnO/PDA/RGDC上的水接觸角及示意圖。

誤差條表示均值± 標準差: *P < 0.05 and ***P < 0.001 (t檢驗)

圖3 材料的制備與表征3

(A) Ti-ZnO, Ti-ZnO/PDA,和Ti-ZnO/PDA/RGDC的鋅離子累積釋放量；

(A1) 短期釋放；

(B)對應A1的溶液pH值；PDA的降解

(C)紫外可見吸收光；

(D) 對應照片, (E) 對PDA化學降解途徑（R組圖S5）提出的化學公式；

(F) Ti, Ti-ZnOs, Ti-ZnO, Ti-ZnO/PDA和Ti-ZnO/PDA/RGDC的ESR譜；

(G) PDA和PDA/ZnO的1H HMR譜；

(H) Zn-PDA復合物的結構。

圖4 材料的抗菌性測試1

(A) 多種表面經金葡菌和大腸桿菌處理后的熒光圖像(比例尺 = 50 μm)；

(B) 大腸桿菌和金葡菌種于多種表面的FE- SEM圖(比例尺 = 100 nm). 不同樣本抗菌性：在瓊脂板上再培養的細菌克隆菌落；

(C) 金葡菌和大腸桿菌在不同表面種植的濃度為 107 CFU/mL；

(D) 金葡菌和大腸桿菌從不同表面分離后再培養于瓊脂糖；

(E) 對細菌細胞膜的通透性ONPG水解法測定；

(F)不同樣品處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的蛋白質滲漏分析和(G)ATP水平；

誤差條表示均值± 標準差: *P < 0.05 and ***P < 0.001 (t檢驗)

圖5 材料的抗菌性測試2

(A) 通過減少的百分比來表示的Ti-ZnOs/PDA/RGDC和Ti-ZnO/PDA/RGDC的抗菌性；

金葡菌和大腸桿菌從不同表面分離后再培養于瓊脂糖；

(B)Ti-ZnOs/PDA/RGDC和Ti-ZnO/ PDA/RGDC的累積鋅離子釋放曲線；

(C) Ti, Ti-ZnOs/PDA/RGDC和Ti-ZnO/PDA/RGDC的ESR譜；

(D) 金葡菌和大腸桿菌處理于Ti, Ti-ZnOs/PDA/RGDC和Ti-ZnO/ PDA/RGDC TEM表面后的超薄切片電鏡圖像(約 70 nm) 和對應的EDS譜 (比例尺 = 500 nm). 誤差條表示均值± 標準差: *P < 0.05 and ***P < 0.001 (t檢驗)

圖6 材料在體外的成骨性能測定

(A) 對培養與不同樣本24小時的MC3T3-El細胞進行的F-actin染色(綠色) 和細胞核染色 (藍色) (比例尺 = 50 μm)；

(B) 1，3，7天經MTT法對不同表面細胞存活率的測定；

(C) 1，3，7天對不同表面細胞堿性磷酸酶活性的測定；

(D)7天和14天的茜素紅染色定量分析 ；

7天和14天不同樣本成骨相關基因(E) ALP, (F) RUNX2和(G) OCN 的定量分析

誤差條表示均值± 標準差: *P < 0.05 and ***P < 0.001 (t檢驗)

圖7 H&E染色(比例尺 = 50 μm) and Giemsa染色 (比例尺 = 5 μm) 圖像顯示術后2周和4周軟組織和骨組織的感染情況

圖8 材料在體內的成骨性能測定

(A) Micro-CT 顯示術后四周兔股骨中Ti和Ti-ZnO/PDA/RGDC植入物周圍新骨形成的2D和3D圖像；

(B) 對骨重建的micro-CT 3D圖像定量分析；

(C) VG染色顯示的骨-植入物表面的組織學特征(比例尺 = 200 和 100 μm)；

(D) 通過組織學測定的新骨區域比例和骨-植入物接觸The error bars indicate means ± standard deviations: *P < 0.05, **P < 0.05, and ***P < 0.001 (t test)

誤差條表示均值± 標準差: *P < 0.05 and ***P < 0.001 (t檢驗)

【小結】

研究人員提出了一種全新的植入物表面復合材料氧化鋅/聚多巴胺/精氨酸甘氨酸天冬氨酸半胱氨酸-半胱氨酸納米棒，通過其選擇性物理穿刺和生物功能化來平衡細菌-成骨細胞競爭，能夠有效的抑制細菌同時降低毒性并提高成骨。這項工作提供了一種植入物表面的設計策略，使得種植體同時擁有理想的骨整合能力和抗感染能力。這將在骨科和口腔科中具有巨大的應用潛力。

文獻信息：Li J, Tan L, Liu X, et al. Balancing Bacteria-Osteoblasts Competition through Selective Physical Puncture and Biofunctionalization of ZnO/Polydopamine/Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Cysteine Nanorods[J]. ACS nano, 2017.

【團隊介紹】

天津大學與湖北大學生物材料聯合實驗室，目前主要致力于生物材料特別是醫用植入體包括鈦合金材料的表面功能化改性，例如提高表面的原位抗菌性能和長期的預防細菌感染功能，同時調控表面細胞行為，促進組織再生。

團隊所發表的關于抗菌和組織修復主題系列文章：

ACS Nano, DOI: 10.1021/acsnano.7b05620， 2017

ACS Nano, 2017, 11 (9), pp 9010–9021

ACS Applied Materials and Interfaces, DOI: 10.1021/acsami.7b10818，2017

ACS Biomater. Sci. Eng. 2017, 3, 816?825

Materials Science and Engineering C 79 (2017) 629–637

Materials & Design 130 (2017) 403–412

ACS Applied Materials and Interfaces, vol. 9, no. 31, pp. 26417 – 26428 (2017).

Applied Surface Science 400 (2017) 14–23

ACS Appl. Mater. Interfaces, 2017, 9 (22), pp 19248–19257

本文由材料人編輯部生物材料組孫苗供稿，材料牛編輯整理。

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