【測試技術專欄】熒光探針在超分辨成像中的應用

tt 5年前 (2018-03-28) 7043瀏覽

熒光顯微鏡在分子生物學研究和細胞內環境監測方面都有很重要的應用。而一些成像技術，比如掃描電鏡、掃描隧道顯微鏡和原子力顯微鏡等，雖然能滿足微觀尺度的成像，但由于其對樣品不可逆的破壞和只能針對表面成像的缺點，限制了其在生物體成像中的應用。與此相比，熒光顯微鏡對生物活體的高度相容性，使其可以監測生物體內的一些動態過程。隨著對生物微觀領域探索的發展，對熒光顯微鏡提出了更高的要求。傳統的熒光顯微鏡由于衍射極限的存在，無法對生物體微觀世界進行成像。通過科學家的不懈努力，超分辨成像技術應運而生，實現了衍射極限以內的高分辨率成像。

1.光學衍射極限

點光源通過光學系統成像，由于光的衍射特性，所成的像并不是點，而是有一定半徑的斑，即艾里斑。因此，當兩個點光源的間距縮小到一定程度時，兩個光斑就會疊在一起，使得成像的分辨率降低。這個間距就是光學衍射極限。Ernst Abbe用數學公式推導和表達了光學衍射極限

通常通用物鏡的NA最大值為1.49，因而可以推算出對于可見光，其分辨率大概為200納米。因此可以認為200納米為傳統光學顯微鏡的分辨率極限，200納米以內的微觀結構都無法觀察。

要達到光學衍射極限，需要滿足兩個條件。首先要求物體與像平面的距離要遠大于光的波長；其次點光源要同時發光，這樣衍射光斑才可以疊加在一起。因此，只要光學探針距離物體的距離遠小于光波長，或者點光源在不同時間分別發光，就可以打破衍射極限，實現超分辨成像。

2.超分辨成像技術

常規所用到的超分辨成像技術主要分為兩類。一類是基于熒光單分子的精確定位。比如由莊小威、Eric Betzig等人所發明的熒光活化定位顯微技術（fPALM）、光活化定位顯微技術（PALM）和隨機光學重建顯微技術（STORM）。這些方法都是利用熒光單分子隨機的發光，通過多拍攝幾次的方法，將這些熒光單分子的激發結果相疊加形成整個圖像；第二類是將衍射斑變小，比如受激發射損耗熒光顯微技術（STED）。STED系統需要兩束光，一束為激發光，另一束為損耗光。激發光使衍射斑以內的熒光分子從基態躍遷到激發態，而損耗光則使部分處于衍射斑外圍的電子通過受激發射的方式回到基態。處于光斑中心的電子不受影響，繼續以熒光的方式回到基態，因此有效地減少了衍射光斑的面積，實現了衍射極限以內的成像。

3.用于超分辨成像的熒光探針

由于超分辨熒光成像的在生物學研究中的迅速發展，針對超分辨成像熒光探針的研究與開發也受到了廣泛的關注。這里，主要介紹以下幾類熒光探針在超分辨成像中的應用。

（1）基于二芳烯和螺吡喃生色團的光學開關材料

二芳烯作為一種常見的光致變色材料在數據儲存和光轉換方面都有廣泛的用途。通過將苝單酰亞胺和二芳烯共價連接，可以克服二芳烯熒光量子產率較低的缺點。所形成的熒光探針同時具備了光轉換性質和較高的熒光量子產率。當二芳烯關環時，苝單酰亞胺的發射光譜和二芳烯的吸收光譜重疊，熒光共振能量轉移使苝單酰亞胺的熒光被二芳烯猝滅；當二芳烯開環時，二芳烯的吸收光譜移動，兩者之間的熒光共振能量轉移消失，苝單酰亞胺發光。這個光致變色的分子成功地用在了PALM成像中，分辨率高達100納米，實現了對嵌段聚合物的微觀結構的成像。

螺吡喃作為一種光致變色材料，染料本身是無色的，在紫外光照射后開環形成兩性離子部花菁結構。后者在500-650納米具有顯著的吸收，發光范圍在紅光到近紅外區間。由于螺吡喃的光學開關性質，成功用于PALM成像，并實現了對嵌段共聚物微觀結構的觀察。

基于二芳烯的光學開關材料

基于螺吡喃的光學開關材料

（2）不可逆的光激活熒光探針

除了光學開關材料，光激活探針也能用在超分辨成像中。光激活探針是指一類熒光染料從無熒光發射轉換到熒光發射狀態后，不能再回到初始狀態的分子。

香港科技大學的唐本忠院士課題組報導了一種光激活的熒光探針，o-TPE-ON+，可針對細胞線粒體進行特異性成像。o-TPE-ON+本身由于分子量很強的ICT作用不發光，在光照下發生周環反應，轉換成很亮的c-TPE-ON+。此探針實現了對活細胞線粒體的STORM成像，分辨率達到了納米級別。

不可逆的光激活熒光探針

（3）量子點

量子點是一種納米級別的半導體，通過對其施加一定的電場或者光壓，電子點會發出特定頻率的光。吉林大學吳長鋒課題組將兩種具有較高熒光強度的聚合物PFBT和CN-PPV，通過優化納米再沉淀法制備了分布均一的聚合物量子點。特異性地對活細胞內的亞細胞結構進行標記，實現了活細胞的SOFI成像。

量子點在活細胞超分辨成像中的應用

（4）熒光蛋白

用于超分辨成像的熒光蛋白被分為三類。第一類是不可逆的光激活熒光蛋白，這類熒光蛋白的熒光可以通過特定波長的光激發，激發后不能恢復到激發前不發光的狀態；第二類是光轉移熒光蛋白，這類熒光蛋白的激發光譜和發射光譜可以通過光照來移動改變；第三類是光學開關熒光蛋白，這類熒光蛋白的熒光可以通過光照來實現“開和關”狀態的切換。