賓夕法尼亞大學Nat. Mater.: 局部新生蛋白沉積重構引導三維水凝膠中間充質基質細胞的機械敏感和行為功能調控

【背景介紹】

生理胞外微環境提供了調節細胞行為和功能的物理和化學信號，而水凝膠作為研究細胞-細胞外基質在三維環境中相互作用的重要工具，它可以囊括生理胞外基質的各個方面。現如今，合成水凝膠已被開發成模擬生理細胞微環境的三維（3D）培養系統，并將其用于探索細胞如何感知和響應這些信號，以針對組織工程三維水凝膠的合理設計。雖然基質剛度是調節細胞行為所公認的參數，但水凝膠中其他組分如通過蛋白水解降解重構或材料應力松弛，對調控細胞行為功能也是至關重要的。這些因素對細胞的三維結構特別重要，因為在細胞三維結構中，動態水凝膠重組可以使細胞骨架張力增大、細胞進行增殖和分化。除此之外，細胞還能在水凝膠中合成和沉積蛋白質，包括細胞外基質（ECM）蛋白。然而，盡管這些新生蛋白在細胞外基質周圍中的早期沉積很有可能介導細胞發出物理和化學信號，但是在大多數情況下，其對細胞-水凝膠相互作用的影響往往被忽視了。

【成果簡介】

最近，賓夕法尼亞大學Jason A. Burdick教授團隊首次報道了在復合水凝膠中新生基質細胞粘附和重構的機械敏感調節。利用生物正交標記技術，研究者們觀察了在多種水凝膠中培養一天后的新生蛋白。而在可蛋白降解的兩種共價交聯和動態粘彈性透明質酸凝膠這用于三維生物力學研究的工程水凝膠中，研究者們又觀察了間充質基質細胞分化、YAP/TAZ核轉位和成骨分化。結果表明，抑制細胞對新生蛋白的粘附或新生蛋白重構，會減少間充質基質細胞的分散和YAP/TAZ的核轉位，從而導致基質細胞向脂肪細胞分化的轉變。這項研究著重于新生蛋白在細胞對工程材料感應中的作用，這對于體外細胞信號研究和組織修復應用具有重大的意義。相關成果以“Local nascent protein deposition and remodelling guide mesenchymal stromal cell mechanosensing and fate in three-dimensional hydrogels”發表于Nat. Mater.期刊上。

【圖文導讀】

圖一、包埋hMsCs發生于早期的新生蛋白沉積，與水凝膠類型無關
（a）新生細胞胞外蛋白標記示意圖；

（b）由hMSC包埋在各種水凝膠（海藻酸鹽，瓊脂糖，PEG-MAL，MeHA和NorHA）中新生蛋白質（白色）沉積的代表圖（標尺：200 μm（主圖）和20 μm（插圖））；

（c）培養24小時后包埋hMSC的代表性TEM圖（*，水凝膠；＃，細胞核；標尺：5 μm（頂部）和1 μm（底部））；

（d）hMSCs包埋在不可降解的NorHA水凝膠（9.0±0.7 kPa）中新生蛋白沉積的代表圖（白色），并在生長培養基中培養（添加AHA）6天（標尺：200 μm（主圖）和20 μm（插圖））；

（e）在不可降解包覆hMSCs的NorHA水凝膠中新生蛋白沉積厚度的定量。

圖二、新生ECM蛋白在細胞-水凝膠界面上形成粘附層
（a）NorHA水凝膠與可降解MMP二巰基肽交聯劑通過巰基-烯反應交聯，并結合RGD進行粘附；

（b）在包埋hMSCs的可降解NorHA水凝膠中，新生蛋白的代表圖（白色，通過熒光DBCO標記可見），并在生長培養基中培養6天（標尺：200 μm（主圖）和20 μm（插圖））；

（c）在包埋hMSCs的可降解NorHA水凝膠中新生蛋白沉積厚度的定量；

（d）6天后包埋hMSC的TEM圖（*，水凝膠；標尺：0.5 μm）；

（e）第6天的新生蛋白質、纖連蛋白、層粘連蛋白α5和1型、4型膠原的代表圖（右側放大圖標尺：20 μm）；

（f）累積的新生蛋白質（右側單個通道的放大倍數）和對樁蛋白FAs染色的代表圖（比例尺，20 μm）；

（g）示意圖（左）顯示了由單個Fas產生并生成的強度區域分布圖（右）。

圖三、在可降解的水凝膠中，與新生蛋白的粘附控制著hMsC機械敏感
（a）在未處理6天后，在MMP可降解的NorHA水凝膠中新生蛋白質沉積的代表圖（標尺尺，200 μm（主圖）和20 μm（插圖）），或用針對整聯蛋白α2（抗α2，20 μg ml^-1），人纖連蛋白（HFN7.1，5 μg ml^-1）或可溶性RGD（溶膠RGD，0.5 mM）的單克隆抗體治療；

（b）通過包埋hMSC的可降解NorHA水凝膠中的細胞長徑比和累積的新生蛋白質沉積厚度的定量；

（c~d）在包埋hMSC的可降解NorHA水凝膠中的代表圖（c）和細胞核/質（nuc/cyto）YAP / TAZ比率（d）的定量，在脂肪形成/成骨培養基中培養6天（標尺，50 μm）；

（e）在成脂肪/成骨培養基中培養14天后，對FABP（成脂肪標記物）和Oc（成骨標記物）進行免疫染色（標尺，50 μm）；

（f）14天后成骨細胞（Oc陽性）和成脂肪細胞（FABP陽性）陽性染色細胞的定量（百分比，%）。

圖四、動態水凝膠成分調控粘彈性和細胞分化
（a）GH DN水凝膠形成示意圖，由無RGD肽共價交聯HA水凝膠（MeHA）與DTT交聯得到；將HA與CD（宿主）或Ad（客體）改性后混合組裝得到GH水凝膠；

（b~c）在給定的共價交聯聚合物濃度比例（0.3）b）和增加共價交聯（硫醇與丙烯酸甲酯的比例）在給定GH聚合物濃度（2.50%）c）下，DN水凝膠的儲能模量（G'，彈性組分）和損耗模量（G''，粘性組分）的流變學測量（1 Hz，0.5％應變）;

（c）具有不同的GH濃度但共價交聯比相同（ 0.3），其F-肌動蛋白免疫染色的代表圖和包含在DN水凝膠中的hMSC的長寬比的定量（標尺，20 μm）；

（d）不同共價交聯率、相同GH聚合物濃度、包埋hMSCs的DN水凝膠中細胞長徑比和F-肌動蛋免疫染色及定量的代表圖（2.50%）。

圖五、在動態水凝膠中，細胞增殖和成骨分化需要新生蛋白重構
（a）在生長培養基中6天內，用胞外分泌抑制劑和囊泡運輸Exo-1 抑制劑（120?nM）和重組組織的金屬蛋白酶3抑制劑（TIMP-3，5 nM包覆）處理后的包埋hMSC的DN水凝膠，其新生蛋白質沉積的代表圖（標尺，200 μm（主圖）和20 μm（插圖））；

（b）在包埋hMSC動態水凝膠中的細胞長徑比和累積的新生蛋白沉積厚度的定量;

（c~d）在包埋hMSC動態水凝膠中的代表圖（c）和細胞核/質（nuc/cyto）YAP / TAZ比率（d）的定量，在脂肪形成/成骨培養基中培養6天（標尺，50 μm）；

（e）在成脂肪/成骨培養基中培養14天后，對FABP（成脂肪標記物）和Oc（成骨標記物）進行免疫染色（標尺，50 μm）；

（f）14天后成骨細胞（Oc陽性）和成脂肪細胞（FABP陽性）陽性染色細胞的定量（百分比，%）。

圖六、新生蛋白粘附和重構增強了可降解/動態水凝膠中的細胞分化
細胞與三維水凝膠相互作用，在新生蛋白沉積形成細胞外基質之前，短時間內與其配合連接。水凝膠的性質決定了被包裹的細胞是否能夠分化，但分化需要粘附蛋白和新生蛋白的活性重構。

【小結】

綜上所述，該研究團隊在研究合成水凝膠用于調控基質細胞行為功能時，發現細胞行為功能不僅受最初設計的細胞-水凝膠界面的影響，還受到在培養開始不久后細胞局部沉積的新生蛋白粘附和重構的影響。對于以前相關研究報道常忽略的這一點，他們通過采用新興的胞外蛋白標記方法，深入探究了細胞-水凝膠界面的動態特性，以及該界面在介導細胞行為功能方面時所發揮的協同作用。研究結果表明，在許多水凝膠系統中，新生蛋白形成并重新影響細胞外微環境，當特定的新生蛋白粘附或重構被阻斷時，其基質細胞行為功能會發生特定的變化。此外，作者認為新生的細胞基質蛋白粘附和組裝影響細胞感知，這能解釋其微環境誘導原因；但單個蛋白的功能組裝，以及如何被初始材料導致的一些因素所調控，這個復雜的反饋機制仍有待進一步的研究闡明。

文獻鏈接：Local nascent protein deposition and remodelling guide mesenchymal stromal cell mechanosensing and fate in three-dimensional hydrogels（Nat. Mater. 2019. DOI：https://doi.org/10.1038/s41563-019-0307-6）

本文由材料人高生組我亦是行人編譯，材料人整理。

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