看拉曼光譜（Raman spectra）在頂刊中有哪些出神入化的應用

拉曼光譜（Raman spectra）是一種散射光譜，是1928年印度物理學家C.V.Raman發現的。拉曼效應來源于分子振動(和點陣振動)與轉動，從拉曼光譜中可以得到分子振動能級(點陣振動能級)與轉動能級結構的信息，在有機化學方面常用作結構鑒定和分子相互作用分析，與紅外光譜互為補充，鑒別特殊的結構特征或特征基團。

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拉曼光譜以其信息豐富、制樣簡單、水的干擾小等獨特優點，在化學、材料、物理、高分子、生物、醫藥、地質等領域有著廣泛的應用。拉曼光譜中包含大量信息：拉曼位移的大小、強度及拉曼峰形狀，半高寬等都是是鑒定化學鍵、官能團、結晶度、應變的重要依據。本文主要介紹拉曼光譜在生物、醫學、材料物理、納米光譜學等方面的應用，并從science中選取了幾篇具有代表性的工作進行介紹。

一、納米粒子的拉曼指紋光譜用于DNA和RNA檢測[1]

利用拉曼光譜作為窄帶指紋光譜的概念可以設計大量具有拉曼活性的探針，該方法靈敏度高、選擇性高，且增加了多路復用和比率功能。用寡核苷酸和有拉曼活性的染料標記的金納米顆粒探針可對寡核苷酸靶標進行多重檢測。被染料標記的顆粒被靶分子和微陣列形式的底層芯片捕獲，銀涂層充當染料標記顆粒的表面增強拉曼散射促進劑，金納米顆粒用于促進銀涂層的形成。本文具體使用六個具有拉曼標記的納米顆粒探針分析了六個不同的DNA靶標，以及具有單核苷酸多態性的兩個RNA靶標。

圖1.

a, b銀涂層表面增強前后的掃描示意圖，c某個Ag spot處的拉曼光譜，d. 對應b圖各點在1192cm^-1處的拉曼強度分布

在銀增強之前，納米顆粒探針肉眼不可見，檢測不到拉曼散射信號，銀增強之后，Ag納米顆粒可以在染料標記的納米顆粒探針周圍生長，增強拉曼散射，而且其他市售染料也具有不同且可測量的SERS信號能夠用于多重檢測。通過DNA合成將六種不同的染料摻入寡核苷酸中，制備出了六種類型的拉曼標記和寡核苷酸修飾的Au納米顆粒探針，檢測甲型肝炎病毒（HVA），病毒表面抗原基因（HVB），人類免疫缺陷病毒（HIV），埃博拉病毒（EV），天花病毒（VV）和炭疽芽孢桿菌（BA）。

圖2.

a六種染料標記的納米顆粒探針在銀涂層表面增強后的拉曼光譜，b 具有相應靶分析的六種DNA

因為此方法中可用的拉曼染料的數量遠遠大于可用和可辨別的熒光染料的數量，與傳統的基于熒光的檢測方法相比，這種指紋識別方法更靈活，多路復用能力更強。而且該方法結合了基于Au納米顆粒的檢測先前的所有優點，比基于類似分子熒光法高幾個數量級的高靈敏度和高選擇性。納米粒子在生物診斷研究的標記技術中越來越重要。

二、受激拉曼散射顯微鏡實現高靈敏度的無標記生物醫學成像[2]

無標記化學對比在生物醫學成像中非常重要。普通的拉曼顯微鏡雖然能提供化學鍵的特定振動特征，但靈敏度低。而基于受激拉曼散射（SRS）的三維多光子振動成像技術通過施加高頻（兆赫）相敏檢測，能夠實現極高的靈敏度，圖像無背景且化學對比度易于解釋。可在生物醫學中應用，例如區分活細胞中ω-3脂肪酸和飽和脂質的分布，基于內在脂質對比的腦和皮膚組織成像，監測通過表皮的藥物遞送等。

圖1. SRS原理與設計，及其與普通拉曼成像的相關對比。

圖2.

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a. DHA, EPA, AA,OA的普通拉曼光譜，b. 脂滴（LD，紅線）和細胞核內區域（藍線）的SRL光譜，c. 2920cm^-1處細胞的SRL圖像，d. 3015cm^-1處相同細胞的SRL圖像。

圖3. 小鼠組織SRL成像

小鼠腦胼胝體神經元髓鞘、腦組織、耳朵、皮膚等處-CH₂?的SRL成像十分清晰，且組織中的自發熒光不會干擾SRS，與CARS成像比較，SRL成像沒有非共振背景，更加直觀利于解析。

三、表面增強共振拉曼散射“納米星”用于高精度癌癥成像[3]

無法可視化癌癥的擴散程度是腫瘤學領域的重大挑戰，因為癌癥能擴散滲透到周圍的組織，大多數癌癥的擴散邊界不能被清晰地劃分。此外，癌癥可能是多灶性的并且存在微觀衛星病變，容易持續存在，局部復發和轉移擴散，現有的成像技術不可能將其可視化。但是臨床和手術需要一種揭示腫瘤真實擴散程度的成像方法，Stefan等人使用新一代表面增強共振拉曼散射（SERRS）納米粒子（稱為SERRS納米星）顯示腫瘤邊緣，做到局部區域腫瘤擴散的精確可視化。SERRS納米星具有星形金核，在近紅外光譜中有拉曼共振，且不引入雜質。在基因修飾的小鼠模型中，以及一種人肉瘤異種移植模型中，SERRS納米星能夠準確檢測到胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和肉瘤等肉眼可見的惡性病變以及其他顯微疾病，而無需靶向部分。此外，SERRS納米星的靈敏度（1.5 fM檢測限）允許對胰腺和前列腺腫瘤的癌前病變進行成像。高靈敏度和廣泛的適用性，結合其惰性金-二氧化硅組合物，使SERRS納米星成為一種有前景的成像劑，用于更精確的癌癥成像和癌癥切除。

圖1. 小鼠模型中的乳腺癌成像

AB圖是右上胸腺和右下胸腺中形成兩個相鄰的腫瘤，C圖是沿著白色虛線切除腫瘤后切除床的光學圖像和拉曼成像。未切除腫瘤時，抗PEG IHC染色顯示腫瘤中存在SERRS納米星，從拉曼成像中也能清晰直觀的看到殘留的腫瘤部分，與切除后PyMT染色顯示的殘留腫瘤位置形狀等高度吻合。

SERRS納米星是一類新的分子成像劑，能夠描繪原發腫瘤，尺寸小至100微米的局部腫瘤沉積以及癌前病變。而且文中對相關動物模型的研究發現，無論在癌癥哪個階段這都是可行的。所以有望將拉曼成像用于腫瘤學的臨床應用：改進圖像引導腫瘤切除，使用拉曼內窺鏡進行早期癌癥檢測，更深層組織的非侵入性成像。

四、拉曼掃描電子顯微鏡（RISE）成像[4]

隨著各類研究的深入，對表征技術的要求也越來越多樣化，不同的表征技術相互結合相互補充，做到1+1>2的現象也越來越多。有的儀器公司已經將拉曼成像和掃描電子顯微鏡結合，推出了拉曼掃描電子顯微鏡。這是一種無標記的非破壞性技術，可以用于識別樣品的分子組成并成像。SEM使樣品的表面結構可視化，其相關的能量色散X射線光譜學能識別元素成分，但難以表征物質的化學結構，而拉曼可以對分子結構進行分析，將兩種技術集成到一起能夠大大加快實驗進程。拉曼掃描電子顯微鏡是將拉曼顯微鏡所需的物鏡和樣品臺放置在SEM的真空室內，用極其精確的掃描軟件驅動機制在拉曼和SEM測量位置之間轉移樣品。可用于納米技術，生命科學，地球科學，制藥和材料研究等領域。

圖1. 拉曼掃描電子顯微鏡

常見的還有拉曼與AFM，氣相、液相色譜聯用，以及現在使用非常多的電化學原位拉曼技術，有興趣的同學可以深入了解一下。

五、拉曼表征單壁碳納米管功能化的電子結構控制[5]

單壁碳納米管制備的一大挑戰就是操控其電子結構，已知的制備方法能夠制備半導體，半金屬和金屬類型的碳納米管。帶隙熒光和拉曼光譜的光譜識別，能夠極大地提高對分散在溶液相中的納米管的不同電子結構的監測能力，明確其半導體、半金屬和金屬特性。

圖1. 功能化碳納米管在532?nm下的拉曼光譜

官能化增加了單壁碳納米管在拉曼光譜中1330cm^-1處的峰強度，對應于sp³?C_sp²?C 形成時sp²?C向sp³?C的轉化。D峰是破壞石墨烯平面基本對稱性的缺陷通過聲子發射共振增強的電子散射。分析功能化程度不同的單壁碳納米管發現，無序模式D峰強度隨著功能化的增加而急劇增加，然后隨著系統失去電子共振而減小。切向模式（TM）的峰強度隨著功能化的增加而降低。

圖2. 四個金屬性質碳納米管（黑色）和半導體性質的碳納米管（紅色）的低波數拉曼光譜

每1000個碳連接5.6個基團后，功能化使得碳納米管的拉曼光譜發生顯著改變，在比率為22.4之后，光譜信息能夠明確區分開金屬性和半導體性質的碳納米管。拉曼光譜可以成功表征功能化單壁碳納米管的電子結構。

小結

表面增強拉曼和共焦顯微拉曼光譜等新拉曼技術，解決了拉曼光譜在早期應用中存在的很多問題，如熒光干擾、固有靈敏度低等，而且近年來先進激光器的發展和其他光譜技術的不斷革新，與氣相、液相色譜，SEM/AFM等儀器的聯用拓寬了拉曼光譜的應用范圍，研究分子微觀動力學，蛋白質構相，超導體等等。

[1] Y.C. Cao, R. Jin, C.A. Mirkin, Nanoparticles with Raman Spectroscopic Fingerprints for DNA and RNA Detection, Science, 297 (2002) 1536-1540.

[2] C.W. Freudiger, W. Min, B.G. Saar, S. Lu, G.R. Holtom, C. He, J.C. Tsai, J.X. Kang, X.S. Xie, Label-Free Biomedical Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy, Science, 322 (2008) 1857-1861.

[3] S. Harmsen, R. Huang, M.A. Wall, H. Karabeber, J.M. Samii, M. Spaliviero, J.R. White, S. Monette, R. O’Connor, K.L. Pitter, S.A. Sastra, M. Saborowski, E.C. Holland, S. Singer, K.P. Olive, S.W. Lowe, R.G. Blasberg, M.F. Kircher, Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging, Science Translational Medicine, 7 (2015) 271ra277-271ra277.

[4] New Products, Science, 353 (2016) 509-509.

[5] M.S. Strano, C.A. Dyke, M.L. Usrey, P.W. Barone, M.J. Allen, H. Shan, C. Kittrell, R.H. Hauge, J.M. Tour, R.E. Smalley, Electronic Structure Control of Single-Walled Carbon Nanotube Functionalization, Science, 301 (2003) 1519-1522

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