華科張志平團隊 Nano Lett. 報道: 胞內產生具有免疫功能的金納米粒子用于結合光熱療和免疫療法

【背景介紹】

金納米粒子（AuNPs）已被廣泛研究用于光熱療法（PTT）和治療診斷劑的藥物遞送系統，是生物醫學應用的一種有希望的候選物。因為AuNPs具有高效的光熱轉換效率、良好的光穩定性、低毒性、明確的物理化學性質等優點。但是傳統的AuNPs大多采用化學方法合成，需要使用有毒的封端劑和還原劑，以及高溫或高壓等危險條件。鑒于某些過渡金屬可以在細胞內借助細胞膜和細胞質的碳水化合物和氧化還原酶以轉化為金屬納米粒子，所以在細胞內產生AuNPs是一種綠色且簡便的方法，且可以賦予其生物信息。但是AuNPs在現階段不足以抑制腫瘤轉移和復發。眾所周知，幾乎所有細胞都能分泌參與各種生物交流的囊泡，作為母體細胞的縮影。據報道，囊泡可用作癌癥疫苗，用于調節系統免疫力的治療劑，或用于對抗癌癥的藥物遞送載體。其中，腫瘤衍生的囊泡可以將腫瘤抗原傳遞給樹突細胞（DC）并實現抗原的加工和呈遞給T細胞以誘導隨后的免疫應答。DC衍生的囊泡可以作為DC的縮影，改善生物相容性，并保持增強免疫應答的能力。因此，將囊泡和AuNPs結合或許可以將兩者的優勢組合，在保持AuNPs原有功能外，還可以抑制腫瘤的復發和轉移。

【成果簡介】

近日，華中科技大學的張志平教授（通訊作者）課題組通過細胞內生成和胞吐作用開發了一種新的具有免疫功能的AuNPs，用于結合PTT和免疫治療。首先使用黑素瘤B16F10細胞產生AuNPs，然后將AuNPs捕獲的囊泡釋放到具有保留腫瘤抗原的細胞外環境中（AuNP@B16F10）。通過進一步將納米顆粒引入樹突細胞（DC），產生具有增強生物安全性的DC衍生的AuNPs（AuNP@DC_B16F10），其可以誘導產生高溫并引起抗腫瘤的免疫應答。該免疫納米平臺顯示出有效抑制甚至根除原發性腫瘤、腫瘤轉移以及腫瘤復發，進而顯著提高了小鼠的總體存活率。總之，通過該方法制備的具有免疫學特性的細胞內產生的AuNPs可以作為癌癥的有效治療方式。研究成果以題為“Intracellularly Generated Immunological Gold Nanoparticles for Combinatorial Photothermal Therapy and Immunotherapy against Tumor”發布在著名期刊Nano Lett.上。

【圖文解讀】

圖一、細胞內形成和表征AuNP@DC_B16F10
（A）在4 d內從B16F10細胞產生和排出AuNPs的典型TEM圖像；

（B）AuNP@B16F10的TEM圖像；

（C）AuNP@B16F10的EDX光譜；

（D）從DC2.4上脫落的AuNP@DC_B16F10的Cryo-TEM圖像；

（E）AuNP DC_B16F10的TEM圖像；

（F）不同濃度的AuNP@DC_B16F10的UV吸收；

（G）激光照射5 min期間，化學合成的AuNP、AuNP@DC_L929和AuNP@DC_B16F10的IR圖像和相應的溫度曲線；

（H）化學合成的AuNP、AuNP@DC_L929和AuNP@DC_B16F10在重復激光照射下的溫度變化（ΔT）。

圖二、納米粒子的蛋白質組學分析
（A）從納米顆粒和母體細胞裂解的蛋白質的比較；

（B）從AuNP@B16F10、AuNP@DC_L929及其母體細胞裂解的蛋白質的比較；

（C）從三種不同納米顆粒裂解的蛋白質的比較；

（D）AuNP@B16F10和AuNP@DC_B16F10之間的56種常見蛋白質，以及AuNP@B16F10和AuNP@DC_L929之間的41種常見蛋白質的熱圖；

（E）從AuNP@B16F10、AuNP@DC_B16F10和AuNP@DC_L929獲得的新抗原和DAMP的比較；

（F）腫瘤抗原的Western印跡分析。

圖三、AuNP@DC_B16F10的細胞毒性和體內特征
（A）在孵育24 h后，用有或無NIR的AuNP@DC_B16F10處理的B16F10細胞的細胞存活率；

（B）B16F10細胞的光熱細胞毒性圖像；

（C）在不同時間點在荷瘤小鼠中用DiR標記的AuNP@DC_B16F10的體內分布；

（D）納米顆粒向iLNs和aLNs遷移的熒光圖像；

（E，F）用激光照射，分別注射PBS、AuNP@DC_L929和AuNP@DC_B16F10的荷瘤小鼠的IR熱圖像和相應的溫度曲線。

圖四、結合光熱和免疫治療對小鼠黑色素瘤模型的抗腫瘤效果
（A）用PBS、AuNP@DC、AuNP@B16F10、AuNP@DC_L929和AuNP@DC_B16F10處理的腫瘤生長曲線；

（B）不同組的肺結節的代表性H＆E切片；

（C）用不同的激光照射功率抑制腫瘤生長；

（D）在有或無2.0 W·cm^-2激光照射下，不同處理后的腫瘤生長曲線；

（E）第21 d處死小鼠的腫瘤重量；

（F）21 d后處死小鼠，收獲腫瘤用于成像；

（G）具有各種治療的腫瘤的H＆E切片。

圖五、小鼠黑色素瘤模型中光熱治療和免疫治療的協同機制研究
（A）與納米顆粒（AuNP@B16F10和AuNP@DC_B16F10）或納米顆粒脈沖BMDC共孵育后CD3⁺ T細胞的增殖；

（B-D）（B）aLNs、（C）iLNs和（D）腫瘤中DC的成熟；

（E-I）在第三次注射不同制劑后腫瘤中的淋巴細胞，其中（E）CD4⁺ T細胞、（F）CD8⁺ T細胞、活化的淋巴細胞（G）CD3⁺CD8⁺CD107⁺、（H）CD3⁺CD8⁺CD69⁺和（I）CD3⁺CD8⁺顆粒酶B⁺ T細胞的比例；

（J）在最后一次注射后24、48和72 h分離的荷瘤小鼠血清中的細胞因子水平；

（K）在存在或不存在CD4⁺（αCD4）/CD8⁺（αCD8）T細胞加上相應的對照組的情況下，用AuNP@DC_B16F10處理的攜帶B16F10的小鼠的腫瘤生長曲線。

圖六、AuNP@DC_B16F10與NIR照射相結合的Abscopal效應
（A）原發腫瘤的生長曲線；

（B）第19 d收獲的遠處腫瘤的重量；

（C-G）（C）CD11C⁺CD86⁺DC、（D）CD3⁺CD4⁺ T細胞、（E）CD3⁺CD8⁺ T細胞、（F）激活的CD4⁺ T細胞和（G）激活活化遠處腫瘤的CD8⁺ T細胞；

（H）CD3⁺CD8⁺ T細胞和在遠處腫瘤中表達的細胞因子的免疫熒光染色；

（I）具有各種治療的小鼠的存活率。

圖七、AuNP@DC_4T1在4T1腫瘤模型中的抗轉移效果
（A）AuNP@DC_4T1的TEM；

（B）在不同激光功率下，用AuNP@DC_4T1處理的4T1腫瘤的生長曲線；

（C）具有不同處理的小鼠的代表性圖像；

（D）腫瘤生長曲線；

（E）不同處理后肺結節的數量；

（F）不同組的染色肺的代表性圖像；

（G）不同組的肺結節的代表性H＆E切片。

【小結】

綜上所述，作者開發了一種新的細胞內產生的免疫納米平臺，用于PTT和免疫療法的聯合抗腫瘤作用。利用細胞特性，在保留原始生物信息下在細胞內生成AuNPs，然后作為納米微粒捕獲囊泡進行胞吐。在進一步引入樹突狀細胞（DC）后，來源于樹突狀細胞的免疫納米粒可增強生物相容性，激活免疫反應，促進樹突狀細胞成熟、多種細胞因子分泌和T細胞活化。誘導的抗腫瘤免疫應答與AuNPs的PTT結合，不僅能有效地根除腫瘤，而且對腫瘤的轉移和復發有充分的預防作用。因此，通過細胞內產生的免疫AuNPs提供了一種有效的癌癥治療策略。納米顆粒介導的腫瘤治療在多種腫瘤模型中顯示出廣泛的適用性，表明納米平臺的通用性。通過進一步開發特定的細胞內環境和代謝，可以針對不同的疾病生成具有可控生物信息的納米平臺。

文獻鏈接：Intracellularly Generated Immunological Gold Nanoparticles for Combinatorial Photothermal Therapy and Immunotherapy against Tumor（Nano Lett., 2019, DOI: 10.1021/acs.nanolett.9b02903）

本文由CQR編譯。

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