納米材料叢林中翩翩起舞的“基因魔剪”

近年來，基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術在整個科學領域都引起了眾多研究學者的興趣。作為一種基因剪輯系統，它可以對某一核苷酸序列中的特定基因位點進行人為改變，插入、刪除、替換或修飾基因組中的特定目的基因使其表達性狀發生改變。迄今為止，CRISPR-Cas9已經可以用于多種疾病的治療，但是在臨床應用具有可行性之前，仍然存在一些技術障礙。由于它是一種大的分子復合物，很難將CRISPR/Cas9直接遞送到細胞核中，只有在細胞核中，它才能發揮它的作用；同時由于CRISPR/Cas9直接在基因層面進行剪切，如何將它靶向遞送到特定的組織器官也是一個較大的難題。因此，解決其在臨床應用中的使用和效力將能夠進一步推動CRISPR/Cas9的發展。

目前，已存在一些技術和方法來實現胞內遞送CRISPR/Cas9復合物，比如通過電穿孔可以直接將CRISPR/Cas9復合物轉導到靶細胞的細胞核；或者通過病毒載體介導的方式來實現傳遞。然而傳統的這些基因遞送的方式仍然存在一些比如安全性低、效率不高的問題。因此，近年來有很多研究采用智能型的納米材料來突破傳統載體對CRISPR/Cas9復合物遞送的局限性。下面，就跟筆者來一起看看近幾年來基于CRISPR-Cas9的智能型納米材料的研究進展吧~

由于傳統病毒載體存在很大的安全問題，2016年在ACS Nano上面報道了來自四川大學華西醫院生物治療與癌癥研究中心國家重點實驗室的一項研究，該研究設計了一種多功能靶向細胞核的“核殼結構”的仿生病毒納米粒子（RRPHC）來實現對細胞核的靶向遞送^[1]。RRPHC仿生病毒(RRPHC/Cas9-hMTH1)由一種氟化聚合物(PF₃₃)來實現對CRISPR-Cas9系統的結合(PF₃₃/Cas9-hMTH1納米粒子)，和一個多功能納米材料修飾的外殼(RGD-R8-PEG-HA, RRPH)共同組成。這樣的多層聚合物納米粒子外表修飾了PEG側鏈和靶向肽RGD修飾的透明質酸HA，賦予了聚合物納米粒子的深度穿透能力。HA可以多種腫瘤表面過表達的CD44受體起到靶向作用，同時帶負電荷的HA可以在細胞外基質中的透明質酸酶HAase的作用下發生降解，暴露出正電荷的PF₃₃/Cas9-hMTH1內核結構，促進細胞內吞和避免系統給藥的快速清除作用。此外，RGD多肽對腫瘤血管內皮細胞上的αvβ3整合素有靶向作用，進一步實現聚合物納米粒子的深層穿透性。研究結果表明，這樣的基于多層功能性聚合物納米粒子的仿生病毒通過雙重受體介導的內吞作用有效的將CRISPR/Cas9復合物靶向遞送到卵巢癌，并且副作用較小，解決了例如腺病毒一類傳統的病毒載體安全性以及效率低的遞送問題。

圖一：多層功能型“仿生病毒”聚合物納米粒子示意圖

由于CRISPR/Cas9復合物在細胞核內經過溶酶體內過酸性的環境，會很快被降解而失去作用，大大降低了基因編輯的效率。因此，需要尋求一種快速溶酶體逃逸，保護蛋白復合物的方式來提高遞送效率。傳統的基因載體會選擇正電性較強且能吸質子H⁺的聚合物如聚乙烯亞胺PEI，然后PEI在應用中由于存在較大的毒性而受到了一定的限制。因此，一些研究逐漸聚焦于安全且有效的陽離子聚合物來現實高效的溶酶體逃逸。2017年，發表在國際期刊Nature?Biomedical?Engineering?上面的一項研究，該研究采用了生物相容性好的金納米粒子AuNP作為內核，可以用來封裝CRISPR/Cas9復合物^[2]。外殼包裹一層生物安全性以及細胞相容性良好的陽離子聚天冬酰胺衍生物PASp(DET) 作為內涵體逃逸的保護殼來實現對同源介導的雙鏈DNA修復，從而對杜氏肌營養不良癥的小鼠達到一個良好的治療。

圖二：CRISPR–Gold納米復合物形成及細胞內化原理

除此之外，2017年發表在ACS Nano上面的文章也報道了一種基于金納米粒子內核的非病毒納米載體^[3]。該納米運載系統以精氨酸修飾的金納米粒子為內核，通過Au-S鍵作用將Cas9蛋白和sgRNA共同自組裝成納米復合物，通過膜融合的方式被細胞攝入。由于精氨酸帶有大量氨基，可以很好的吸收質子保護蛋白復合物在溶酶體內酸性環境不受破壞，從而實現有效的將其地送到細胞核發揮作用。該文章表明，基于膜融合被細胞內化的納米系統可以達到大約90%的遞送效率，同時對于不同的細胞系可以達到約30%的基因編輯效率。

圖三：CRISPR–ArgNPs作用機理示意圖

盡管陽離子聚合物可以保護蛋白復合物通過溶酶體逃逸，但較強的正電性使得其在系統給藥之后很容易被清除，仍然存在一些局限性使其不能很好的進入臨床應用。2016年和2019年分別發表在PNAS和Advanced?Materials上面的兩項研究報道了迄今為止納米材料遞送CRISPR/Cas9復合物最為有效的手段之一。這兩項研究都報道了一種生物可降解的合成脂質納米粒子，脂質納米顆粒通過靜電作用吸附了Cas9的信使RNA（mRNA）^[4,5]。當這些包含sgRNA的納米顆粒的內含物釋放到細胞中，細胞中的蛋白制造工廠接管這種mRNA模板，并利用這種模板表達Cas9蛋白，從而實現這種基因編輯工具的作用。這些納米顆粒的共同特征在于它們是由脂肪鏈中含有二硫鍵的合成脂質自組裝形成的。當這些納米粒子進入細胞中時，細胞中的環境破壞了二硫鍵而將它們拆解開，從而導致它們中的內含物快速高效地釋放到細胞中，同時研究報道這種基于還原響應的納米脂質體對基因編輯效率可達90%。

圖四：基于還原響應納米脂質體CRISPR/Cas9復合物的作用機理示意圖

由于CRISPR/Cas9是在基因層面對細胞DNA進行刪除或者插入，所以其作用到的靶器官與其他正常組織器官將會存在潛在的致癌風險。因此，選擇性的激活特定組織或器官中的CRISPR/Cas9復合物的表達，以達到最大化的治療效果，實現最小化的系統毒性。2019年發表在Nature?Biomedical?Engineering上面的一項研究報道了一種新型的磁場控制的基因載體系統^[6]。這樣的一種CRISPR遞送系統主要由一種大尺寸的桿狀病毒實現對CRISPR復合物的包載，同時在病毒表面靜電復合了穿模肽TAT修飾的磁性納米粒子。該系統可以在磁場的作用下有效的富集在肝臟組織中，同時在磁場的控制下實現對體內基因編輯的空間控制。

圖五：基于磁場控制的CRISPR/Cas9復合物示意圖

除了磁場控制，還有一些研究聚焦于利用光控制CRISPR/Cas9復合物在特定組織的空間控制。2019年發表在Science?Advances上面的一項報道，實現了用近紅外光對CRISPR/Cas9復合物的定點控制釋放^[7]。這樣的光控制載體系統由鑭系元素摻雜的上轉換納米粒子（upconversion nanoparticle, UCNP）組成。其中，UCNP修飾了紫外敏感斷鍵的化學基團ONA，同時復合CRISPR/Cas9蛋白并在外層包裹了PEI實現有效的溶酶體逃逸。當近紅外光照射時，這種光被吸收并轉換成紫外光進而引起化學鍵斷裂，從而實現對CRISPR/Cas9復合物的切割釋放，到達近紅外光激活的空間控制。與此同時，在Advanced?Materials上面也發表了光控制CRISPR/Cas9表達的相關研究，該研究報道了一種刷狀結構的含氟化聚乙烯亞胺（PF）的半導體聚合物，其中PF可以與CRISPR/Cas9結合，同時聚合物納米粒子內核包載了一種可以使核擴張的糖皮質激素^[8]。聚合物外殼修飾了聚乙二醇PEG，通過超分子和靜電作用形成半導體聚合物納米粒子。當該聚合物納米粒子在特定組織富集之后，給與近紅外光照，半導體聚合物進行光熱轉換之后快速釋放出CRISPR/Cas9復合物。以上兩項研究都利用外界光刺激，實現體內基因編輯的空間控制，通過無創遙控，巧妙地利用智能型納米材料，將提高體內CRISPR/Cas9編輯的準確性和安全性。

圖六：基于光控制CRISPR/Cas9復合物的示意圖

總結與展望

近年來大量的研究通過智能型的納米系統去對CRISPR/Cas9的可控編輯以及遞送效率不斷地進行完善和優化，不論是通過設計精巧而復雜的多重功能的納米材料還是利用外界刺激，如光、聲、磁、熱等對CRISPR/Cas實現空間的遠程控制，多功能的智能納米材料具有可調節性，靈活性，和可控性，相較于傳統的基因載體對CRISPR/Cas9編輯系統都實現了有效的遞送并且大大的提高了編輯效率。基于以上的一些進展梳理，讓我們拭目以待CRISPR/Cas9與納米材料的精妙結合，使其能夠盡早的轉化到臨床應用之上！

參考文獻

[1] Artificial Virus Delivers CRISPR-Cas9 System for Genome Editing of Cells in Mice.?ACS Nano, 2017, 11, 95?111, DOI: 10.1021/acsnano.6b04261

[2] Nanoparticle delivery of Cas9 ribonucleoprotein and donor DNA in vivo inducehomology-directed DNA repair. NatureBiomedical?Engineering, DOI: 10.1038/s41551-017-0137-2

[3] Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano, 2017, 11, 2452?2458, DOI: 10.1021/acsnano.6b07600

[4] Efficient delivery of genome-editing proteins using bio-reducible lipid nanoparticles. PNAS, 2016, 2868–2873, doi/10.1073/pnas.1520244113

[5] Fast and Effcient CRISPR/Cas9 Genome Editing In Vivo Enabled by Bio-reducible Lipid and Messenger RNA Nanoparticles. Advanced Materials, 2019, 1902575, DOI: 10.1002/adma.201902575

[6] Spatial control of in vivo CRISPR–Cas9 genome editing via nanomagnets. NatureBiomedical?Engineering, doi.org/10.1038/s41551-018-0318-7

[7] Near-infrared upconversion–activated CRISPR-Cas9 system: A remote-controlled gene editing platform. 2019; 5 eaav7199, DOI: 10.1126/sciadv.aav7199

[8] A Rationally Designed Semiconducting Polymer Brush for NIR-II Imaging-Guided Light-Triggered Remote Control of CRISPR/Cas9 Genome Editing. Advanced Materials, 2019, 1901187, DOI: 10.1002/adma.201901187

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