李亞平&于海軍Nano Lett.：前藥囊泡用于腫瘤的光動力免疫治療

【研究背景】

免疫檢查點阻斷（ICB）治療在轉移性或晚期腫瘤的臨床治療中引起了廣泛關注。ICB療法可以誘導針對腫瘤消退的全身保護性免疫應答，但是由于腫瘤細胞的免疫原性低和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的腫瘤內浸潤不足，只有一部分癌癥患者對目前的ICB治療有反應。研究者們目前已開發出包括化學療法、放射療法和光動力療法（PDT）在內的幾種治療方式來引發抗腫瘤免疫反應。PDT可以誘導活性氧（ROS）生成，從而觸發免疫原性細胞死亡（ICD）級聯反應。經歷ICD的腫瘤細胞在細胞膜表面表達鈣網蛋白（CRT），并分泌高遷移率組蛋白1（HMGB1）蛋白和三磷酸腺苷（ATP）募集CTL。此外，一些研究表明，PDT可通過上調促炎因子（如熱休克蛋白70（HSP70）和轉錄因子核因子κB（NF-kB）的表達來觸發免疫反應。

【成果簡介】

近日，中科院上海藥物研究所李亞平研究員和于海軍研究員聯合證明了通過抑制吲哚胺2，3-二加氧酶1（IDO-1）可以克服免疫耐受。作者通過整合PEG化光敏劑（PS）和IDO-1抑制劑的還原敏感性前藥，合理設計了可在腫瘤微環境中脫落的前藥囊泡。前藥囊泡在血液循環中是惰性的，而它們通過MMP-2介導的PEG裂解特異性地聚集在腫瘤部位，從而實現了熒光成像引導的PDT。與單獨的PDT相比，前藥-囊泡介導的聯合免疫療法在CT26大腸和4T1乳腺免疫功能正常的小鼠模型中均增強了抗腫瘤免疫力。前藥囊泡顯著抑制了腫瘤復發。該文章近日以題為“Sheddable Prodrug Vesicles Combating Adaptive Immune Resistance for Improved Photodynamic Immunotherapy of Cancer”發表在知名期刊Nano Lett.上。

【圖文導讀】

圖一、納米材料制備及細胞作用過程示意圖

（a）用于組合光動力免疫療法的MMP-2響應脫落和GSH活化的前藥囊泡的示意圖；（b）EAPV介導的光動力免疫治療的機制。

圖二、EAPV的化學物理表征

（a）HPLC色譜圖和（b）在37°C下與MMP-2（2.5 μg/mL）孵育后PGGP的降解率。（c）由DLS確定的EAPV和PV的水動力粒徑分布。（d）EAPV和PV的紫外-可見光譜。（e）EAPV和PV的熒光性質；插圖顯示PBS（上圖）或SDS（下圖）中EAPV的NIR熒光成像。（f）分別與2.5 μg/mL MMP-2孵育0、4和24 h后，EAPV的代表性TEM圖像（比例尺為100 nm）。（g）EAPV的多分散性指數（PDI）和（h）流體動力學直徑的變化與孵育時間和MMP-2濃度的關系。

圖三、體外EAPV的細胞內攝取和光活性

在PPa濃度為2.0 μM的條件下用（a）CLSM和（b）體外流式細胞術分析CT26細胞中EAPV的細胞內攝取。（c）CLSM分析CT26細胞MCS中的EAPV和PV分布。（d）沿箭頭方向的CT26細胞MCS中EAPV和PV的熒光強度分布圖和（e）2.5-D熱圖。（f）流式細胞術分析CT26細胞中EAPV產生胞內ROS。（g）將CT26細胞與NLG-919，NPC，p-lysoPC或EAPV孵育48小時后的細胞活力。（h）EAPV在體外CT26細胞中的光毒性。（i）PDT觸發的CRT暴露和（j）體外CT26細胞的HMGB1外排。（k）體外DC成熟測定的示意圖。（l）EAPV誘導的DC體外成熟。

圖四、體內前藥囊泡的生物分布和藥代動力學特征

（a）靜脈注射EAPV和游離NLG919后，Balb/c小鼠血漿NLG919的濃度-時間曲線。（b）CT26荷瘤小鼠體內EAPV和PV分布的IVIS圖像。（c）注射后24小時檢查的腫瘤部位的標準化熒光強度。（d）注射后24小時檢查的離體荷瘤小鼠主要器官中EAPV和PV分布的IVIS圖像。（e）主要器官的標準化熒光強度。（f）注射后4 h檢查CT26腫瘤切片中EAPV分布的CLSM圖像。

圖五、體內抗腫瘤作用和免疫學指標分析

（a）EAPV治療策略的示意圖。（b）4T1和（c）CT26腫瘤模型的腫瘤體積變化。（d）4T1荷瘤小鼠和（e）CT26荷瘤小鼠的生存曲線。（f）體內CT26腫瘤表面CRT表達的免疫熒光和（g）HMGB1外排在CT26腫瘤中的免疫熒光。（h）腫瘤引流淋巴結的照片，以及（i）在腫瘤引流淋巴結中的成熟的DC的比率。（j）腫瘤組織中腫瘤內浸潤T淋巴細胞的比率。（k）治療后3天檢查的IFN-γ⁺ CTLs 的代表性流式細胞曲線。

圖六、EAPV誘導的體內ICD

（a）IDO-1的免疫組織化學染色。（b）蛋白質印跡分析CT26腫瘤中IDO-1的表達，以及（c）體內腫瘤組織中GAPDH標準化的IDO-1的表達。（d）IFN-γ孵育后體外對CT26細胞中IFN-γ誘導的IDO-1表達進行WB分析，以及（e）CT26細胞中GAPDH歸一化IDO-1表達。（f）不同治療后CT26腫瘤組織中的Kyn/Trp比（第一次治療后12小時收獲腫瘤組織）。（g）在腫瘤治療結束時檢查的腫瘤組織中Tregs的流式細胞曲線。（h）腫瘤組織中CTLs與Tregs的比率。（i）前藥囊泡進行的光動力免疫治療的示意圖。

【結論展望】

綜上所述，本研究合成了聚乙二醇化光敏劑和NLG919前藥（NPC），制備了可切斷的前藥囊泡（EAPV），該囊泡具有均一的粒徑分布，良好的血清穩定性以及MMP-2和GSH雙重響應能力。EAPV還具有很強的攝取能力，并能深入腫瘤組織。體內和體外實驗證明，EAPV可以有效產生ROS，誘導腫瘤細胞的ICD，并最終增強DC對腫瘤細胞的免疫識別。體內抗腫瘤結果顯示，在CT26皮下腫瘤模型中EAPV的抗腫瘤功效比在4T1腫瘤中更好。在不同腫瘤模型中的不同治療潛力突顯了IDO-1生物標記物對高效光動力免疫療法的重要性。

文獻鏈接：Sheddable Prodrug Vesicles Combating Adaptive Immune Resistance for Improved Photodynamic Immunotherapy of Cancer (Nano Lett., 2019, DOI: 10.1021/acs.nanolett.9b04012)

李亞平研究員：藥劑學博士，研究員，國家基金委創新群體學術帶頭人，杰出青年基金獲得者，973首席科學家，國家萬人計劃、中科院百人計劃專家，現任中科院上海藥物研究所藥物制劑研究中心主任。研究方向包括納米載藥系統抗腫瘤轉移及克服腫瘤耐藥，核酸藥物非病毒載體及其導入系統，以及創新藥物與高端制劑的研究開發。在Nat Med、Chem Soc、Adv Mater、Sci Immunol、Nat Commun等國際重要學術期刊上發表高質量論文200余篇（其中IF＞10的論文80余篇）。已獲得新藥證書9本, 臨床批件13件（創新藥物制劑臨床批件10件）; 申請專利82件(授權42件)。

于海軍研究員：于海軍研究員長期致力于新型納米載藥系統研究并取得了突出成績：1）構建了系列新型納米載藥系統，激活腫瘤免疫效應并逆轉腫瘤免疫抑制微環境，有效抗腫瘤轉移和復發；2）構建了系列快速響應納米載藥系統克服腫瘤組織和細胞生理屏障，提高藥物轉運效率，顯著改善腫瘤化療和RNA干擾治療效果；3）從分子、細胞和組織層面揭示了上述納米載藥系統抗腫瘤耐藥和轉移的關鍵作用機制。曾獲得科技部中青年科技創新領軍人才和中國藥學會-賽諾菲青年生物藥物獎等科研獎勵及榮譽。主持國家自然科學基金“優秀青年基金”、面上項目和科技部“973”課題等多項科研項目。

本文由大兵哥供稿。

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