中科院朱明昭團隊Nat. Nanotech.報道：雙靶向鐵蛋白納米疫苗引發針對慢性乙型肝炎的治療性抗體反應

【背景介紹】

乙型肝炎（CHB）是由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的全球性健康問題，HBV會攻擊肝臟，從而導致急性和慢性疾病。據估計，目前全球有2.57億人是HBV慢性攜帶者，并有發展為肝病、肝硬化和肝細胞癌的高風險。雖然常規的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）疫苗接種可在大多數健康的接種人群中誘導保護性抗體，并有效降低新的HBV感染的發生率，但是HBsAg在臨床動物模型或CHB感染患者中均無法誘導有效的抗體反應。因此，非常需要一種消除和根除CHB的有效治療策略。

對比HBsAg，HBV大表面抗原的preS1結構區域被認為是治療性疫苗開發的理想免疫原候選物。目前已證明針對preS1的單克隆抗體（MA18/7和KR127）在體內外均能有效抑制HBV感染。同時，抗-preS1還可以通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和吞噬作用消除HBV⁺細胞。此外，在CHB患者中，對preS1的免疫耐受性似乎比對HBsAg的免疫耐受性低得多。研究顯示，preS1抗原疫苗接種而非HBsAg疫苗在HBV攜帶者小鼠中引起中和性治療抗體應答。在自然感染和主動接種中均發現，preS1似乎不是有效的抗體誘導劑。因此，如何提高preS1的免疫原性以增強治療性抗體反應是當前開發基于preS1的治療性疫苗的關鍵問題。

【成果簡介】

基于此，中國科學院生物物理所的朱明昭研究員（通訊作者）團隊報道了一種鐵蛋白納米粒子疫苗，可以將preS1遞送至特定的骨髓細胞，包括SIGNR1⁺樹突狀細胞（激活T濾泡的輔助細胞）和與淋巴竇相關的SIGNR1⁺巨噬細胞（可以激活B細胞）。這種納米顆粒疫苗可誘導高水平且持久的抗-preS1反應，從而在慢性HBV小鼠模型中實現有效的清除病毒和部分血清學轉化，為功能性治愈慢性乙型肝炎提供了一種有希望的可轉化疫苗接種策略。研究成果以題為“Dual-targeting nanoparticle vaccine elicits a therapeutic antibody response against chronic hepatitis B”發布在國際著名期刊Nature Nanotechnology上。

【圖文解讀】

圖一、鐵蛋白NP疫苗的分子設計和表征
（a）基于鐵蛋白的疫苗遞送載體的示意圖；

（b）SpyTag-鐵蛋白NPs的尺寸排阻色譜；

（c）在4^oC下，以1：0.5、1：1和1：2摩爾比在SpyTag-鐵蛋白和SC-preS1的共價連接并進行過夜的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析；

（d）鐵蛋白NP-preS1的尺寸排阻色譜；

（e）SpyTag-鐵蛋白NP和鐵蛋白NP-preS1的TEM圖和2D重建；

（f）在第21天疫苗免疫時，利用酶聯免疫吸附測定（ELISA）分析抗-preS1的應答；

（g）免疫后抗-preS1水平的動力學；

（h）比較結合疫苗和未結合疫苗對抗-preS1的應答；

（i）利用ELISA檢測抗preS1 IgG對疫苗免疫的親和力；

（j）第21天，鐵蛋白NP-preS1疫苗或SC-preS1免疫小鼠的血清中preS1特異性IgG1和IgG2c的滴度。

圖二、鐵蛋白NP-preS1疫苗對HBV的保護性免疫
（a）在第0天和第14天用200 pmol鐵蛋白NP-preS1疫苗或等摩爾SC-preS1可溶性抗原、30 μg CpG-1826皮下免疫處理的WT C57BL/6小鼠；

（b）利用ELISA檢測AAV-HBV1.3感染后的preS1血清水平；

（c）在第35天，通過實時PCR定量血清HBV DNA水平；

（d-f）在從鐵蛋白NP-preS1或SC-preS1免疫小鼠或WT小鼠收集的免疫血清中，將HepG2-hNTCP細胞與1×10⁷ vg HBV孵育。

圖三、鐵蛋白NP-preS1作為治療性疫苗
（a）給C57BL/6小鼠靜脈注射1×10¹⁰ vg AAV-HBV1.3病毒。

（b-d）利用ELISA測定血清抗preS1（b）、preS1抗原（c）和HBsAg（d）的水平；

（e）第147天時，測定血清HBV DNA、HBsAg和抗HBs水平；

（f）第147天時，對肝細胞中乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的免疫組織進行化學染色；

（g）第147天時，利用實時PCR對肝臟中的HBV cccDNA進行定量分析；

（h）第147天時，測得收集血清中的谷氨酸-丙酮酸轉氨酶（ALT）和谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶（AST）。

圖四、鐵蛋白NP疫苗靶向不同的APCs
（a）給C57BL/6小鼠皮下注射2 nmol鐵蛋白NP-eGFP；

（b-c）C57BL/6小鼠皮下注射2 nmol鐵蛋白NP-eGFP或等摩爾eGFP-SpyTag；

（d）10天后，注射CLL或對照脂質體（CON），分析DC或CD11c-CD11b⁺巨噬細胞對鐵蛋白NP-eGFP的捕獲；

（e）在CLL或CON治療10天后，鐵蛋白NP-eGFP在pLNs中蓄積2 h后，通過免疫熒光顯微鏡確定注射劑量。

圖五、鐵蛋白NP疫苗誘導有效的Tfh和GC反應
（a）用1×10⁷ Thy1.1+ OT-II脾細胞過繼轉移免疫的Na?ve WT Thy1.2 C57BL/6小鼠；

（b）在免疫的第63天，通過流式細胞術分析來自iLN的GC B細胞；

（c）用抗-B220、抗-GL7和DAPI對iLN的冷凍切片染色；

（d-e）免疫接種12 h后，利用rDC（CD103^-）、miDC（CD103⁺）、CD169⁺巨噬細胞（CD11c-CD11b⁺CD169⁺）和F4/80⁺巨噬細胞（CD11c-CD11b⁺CD169-F4/80⁺）dLNs與未經處理的OT-II T細胞共孵育；

（f）流式細胞術分析證實利用DT處理的CD11c-DTR骨髓嵌合小鼠的iLN中的DC消耗；

（g）免疫后第10天，在CD11c缺失的小鼠中檢測到PreS1特異性IgM和IgG反應。

圖六、B細胞激活和抗體產生需要的SIGNR1⁺巨噬細胞
（a）在f.p.的第3天后，從pLNs中篩選出WT小鼠中的免疫接種，rDC、miDC、SIGNR1⁺巨噬細胞和F4/80⁺巨噬細胞，并與MD4 B細胞孵育；

（b-d）在免疫鐵蛋白NP-preS1疫苗之前，用PBS或抗CSF1R處理野生型小鼠；

（e）免疫后第3天，WT和Cxcr5^-/-小鼠的iLN中SIGNR1⁺細胞的分布；

（f）在WT：Cxcr5^-/-混合骨髓嵌合小鼠中免疫CpG-1826后5 d，iLNs中WT SIGNR1⁺細胞（CD45.1）或Cxcr5^-/-SIGNR1⁺細胞（CD45.2）的顯微鏡觀察；

（g）從注射的f.p.注射的WT或Cxcr5^-/-小鼠的脾臟中分選SIGNR1⁺巨噬細胞。

【小結】

綜上所述，本文的數據表明，在小鼠HBV模型中，通過協調雙靶向SIGNR1⁺樹突狀細胞和LNs中的巨噬細胞，基于鐵蛋白NP的preS1疫苗表現出高效的抗體應答，既具有預防作用，又具有治療作用。該研究可能為今后CHB治療的轉化研究提供一個良好的選擇和新思路。

文獻鏈接：Dual-targeting nanoparticle vaccine elicits a therapeutic antibody response against chronic hepatitis B（Nature Nanotechnology, 2020, DOI: 10.1038/s41565-020-0648-y）

通訊作者簡介

朱明昭，中國科學院生物物理研究所，感染與免疫院重點實驗室，研究員，中國科學院大學崗位教授，博士生導師，中國科學院“百人計劃”引進海外杰出人才。主要從事淋巴組織微環境和T細胞發育和應答，疫苗免疫學等方面的研究。一方面，揭示了淋巴組織微環境多種基質細胞發育和功能的調控機制，揭示了淋巴組織微環境對T細胞發育和應答的影響和作用機制，揭示了T細胞發育和應答的表觀遺傳調控機制；另一方面，開發了基于SpyTag/SpyCatcher的點擊疫苗技術，設計了一系列基于納米膠束和鐵蛋白納米顆粒等載體、靶向淋巴結和抗原呈遞細胞的新型點擊疫苗和納米疫苗，應用于腫瘤和傳染病的免疫預防和治療研究。研究成果發表于Nature, Nature Nanotechnology，Nature Communications, Cell Reports, Cell Discovery, Journal of Immunology, Oncoimmunology, Nanomedicine等雜志。

本文由CQR編譯。

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