上交大ACS Nano：靶向性納米遞送系統攻克系統性紅斑狼瘡

【研究背景】

系統性紅斑狼瘡（Systematic Lupus Erythematosus，SLE）是一種常見的致死性自身免疫性疾病，其特征是效應子/調節性T細胞失衡。目前關于SLE的療法大多無效或具有嚴重的副作用。SLE病因復雜，效應性/調節性T細胞的失衡是SLE 發生發展的關鍵病因。miRNA作為一種負調控分子參與包括T細胞在內的大部分免疫細胞的分化和免疫應答的各個環節，其可調節大約90%的蛋白質編碼基因。越來越多的證據表明，miRNA的失調與SLE的發病有關。因此，miRNA在機體中對免疫細胞的調節作用是 SLE 藥物開發的極好靶點。但免疫原性和高劑量要求阻礙了miRNA治療的應用，因此，開發合適的載體是在體內應用miRNA治療SLE的前提。

【成果簡介】

近日，上海交通大學段友容教授、沈南教授和唐元家副教授聯合開發了一種納米遞送系統（PEAL_miR-125a）遞送miRNA至T細胞，重塑效應T細胞和調節T細胞（Treg）平衡治療系統性紅斑狼瘡。實驗結果顯示，PEAL_miR-125a NPs可以被優先富集在脾臟中，并有效地將miR-125a轉染到MRL/lpr小鼠的T細胞中。然后，作者研究了PEAL_miR-125a NPs治療SLE的療效，發現注射PEAL_miR-125a NPs可以通過恢復效應/調節性T細胞平衡來減輕SLE的發展。此外，與非特異性免疫免疫抑制GC試劑相比，PEAL_miR-125a NPs顯示出極好的安全性。總體而言，PEAL_miR-125a NPs代表了SLE治療的一種有前途的策略。該文章近日以題為“MicroRNA-125a-Loaded Polymeric Nanoparticles Alleviate Systemic Lupus Erythematosus by Restoring Effector/Regulatory T Cells Balance”發表在知名期刊ACS Nano上。

【圖文導讀】

圖一、納米粒子的穩定性以及對藥物的包封及釋放

（A）PEAL_miNC NPs的粒徑分布和TEM圖像。

（B）PEAL_miNC NPs的表面電勢為0.01 mV。

（C-D）在4 ^oC和37 ^oC條件下放置一周PEAL_miNC NPs的粒徑和PDI分布。

（E）游離miNC和PEAL_miNC NPs的體外釋放曲線。

（F）在不同時間點用RNA酶孵育的游離miRNA或PEAL_miNC NPs，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢查miRNA水平。

圖二、PEAL NPs在活化T細胞中的吸收

（A）分別與PBS、游離cy5-miNC、PEG-PLGA_cy5-miNC和PEAL_cy5-miNC孵育6小時的脾臟T細胞的流式細胞分析。

（B）（A）中cy5⁺細胞的含量對比。

（C）將脾臟細胞與PBS、游離cy5-miNC、PEG-PLGA_cy5-miNC和PEAL_cy5-miNC共孵育6小時。流式細胞儀分析原始T細胞和效應T細胞內的cy5⁺細胞含量。

（D）（C）中cy5⁺細胞的含量對比。

（E）將T細胞靜息或活化24小時，然后與PBS、游離cy5-miNC、PEG-PLGA_cy5-miNC和PEAL_cy5-miNC共孵育6小時。對靜息或激活的T細胞中cy5⁺細胞群的流式細胞分析。

（F）（E）中cy5⁺細胞的百分比。

圖三、PEAL_miNC NPs對Treg的作用和抑制功能

（A）在培養過程中，用涂有抗CD3/CD28抗體的平板刺激脾臟T細胞，脾臟T細胞與PBS、PEAL_miR-125a或游離MiR-125a共孵育24小時的MiR-125a水平。

（B，C）用PBS、游離miR-125a或PEAL_miR-125a處理3天的T細胞，在CD3/CD28抗體刺激下IFN-γ和STAT3 mRNA的表達水平。

（D）將脾臟T細胞與Dex或不同濃度PEAL或PEAL_miR-125a共孵育24小時，用流式細胞儀檢測T細胞凋亡率。

（E）用PBS、游離miR-125a、PEAL_miR-125a或Dex平板包被抗CD3/CD28抗體孵育3天的分裂細胞百分比。

（F）CD4⁺ T細胞與PBS、游離miR-125a、PEAL_miR-125a或Dex+TGF-β共孵育不同時間后，細胞內的Foxp3⁺ Treg。

（G）Tregs由PBS、游離miR-125a、PEAL_miR-125a或Dex+TGF-β誘導72小時后，在板包被的抗CD3/CD28抗體下，將Tag-it紫羅蘭標記的常規T細胞與誘導的Treg以2：1的比率孵育不同的時間點。測量了在不同時間點的常規T細胞增殖。

圖四、PEAL_miNC NPs在SLE模型中對miR-125a的有效遞送

（A）將T細胞與PBS，游離cy5-miNC或PEAL_cy5-miNC共孵育6小時后細胞中cy5⁺細胞的流式細胞分析。

（B）（A）中cy5⁺細胞的百分比。

（C）來自用PEAL_cy7-miNC NPs或游離cy7-miNC靜脈注射4小時和24小時的MRL/MpJ小鼠和MRL/lpr小鼠的器官的熒光圖像。

（D）（C）中的脾和肝cy7的MFI。

（E）用PEAL_cy7-miNC NPs或游離cy7-miNC靜脈注射24小時的MRL/MpJ和MRL/lpr小鼠的脾臟T細胞中的cy5⁺T細胞。

（F）（E）中cy5⁺T細胞的統計分析。

圖五、PEAL_miR-125a對脾臟細胞穩態的影響

在第10、11、12周時，向MRL/MpJ小鼠靜脈注射PBS、PEAL_miR-125a NPs（1.5 mg/kg）、相同劑量的PEAL NPs、Dex（1 mg/kg）測量脾細胞。（A-B）脾臟CD4⁺和CD8⁺T細胞數。

（C）CD4⁺T細胞中Treg細胞群的比例。

（D）脾臟中B細胞數目。

（E-G）顯示脾臟巨噬細胞、DC細胞和嗜中性粒細胞的絕對數量。

圖六、PEAL_miR-125a改善SLE小鼠的自身免疫性

（A）動物實驗方案：小鼠每周兩次（分別在第10、11、12和13周）靜脈注射PBS，游離miR-125a、PEAL_miR-125a或Dex。

（B）用PBS，游離miR-125a、PEAL_miR-125a或Dex處理的SLE小鼠的脾臟的對比圖像。

（C）不同處理小鼠的脾臟重量。

（D）在不同時間點測量尿蛋白含量。

（E）通過ELISA測量的血清肌酐水平。

（F）SLE小鼠的皮膚損傷對比。

圖七、PEAL_miR-125a治療減少狼瘡性腎炎

（A）腎臟切片的H＆E染色圖像。

（B-D）腎切片的IHC圖像顯示抗CD3、抗IgG和抗C3的腎沉積。

（E）（A）腎小球性腎炎評估。

（F）（B）中浸潤性CD3⁺T細胞的數量。

（G）（C）中腎臟IgG染色的定量分析。

（H）（D）中腎臟C3染色的定量分析。

圖八、PEAL_miR-125a逆轉SLE中效應/調節T細胞的失衡

（A）治療4周后，各組脾臟T細胞的數量。

（B）各組CD4⁺T細胞內Treg細胞的頻率。

（C）foxp3在CD4⁺T細胞foxp3+群中的MFI。

（D）不同組T細胞內T_fh細胞的百分比。

（E）血清IL-21水平。

（F）血清IL-17a水平。

（G）將MRL/MpJ小鼠經TGF-β誘導分化為Tregs的幼稚T細胞培養72h后，在有或無IL-6的抗CD3/CD28抗體刺激下，與標記為紫羅蘭標記的常規T細胞共培養，并與PBS、游離miR-125a或PEAL_miR-125aNPs共培養。標記紫羅蘭染料+細胞進行門控和增殖分析。

（H）脾臟B細胞的絕對數目。

（I）各組脾臟內漿細胞絕對數。

（J-K）純化的B細胞被紫羅蘭標記，然后與PBS、游離miR-125a或PEAL_miR-125aNPs共孵育3天。B細胞分裂百分率和上清液IgG水平。

【結論展望】

在本研究中，作者成功地構建了PEAL_miR-125a納米給藥系統，實驗證明該納米給藥系統具有很高的生物安全性。實驗表明，PEAL_miR-125a NPs可優先富集于病理性脾臟，并在SLE模型中有效地將miR-125a導入致病性脾臟T細胞。在全身給藥4周后，PEAL_miR-125a NPs納米粒顯著減輕SLE小鼠的病癥。相反，相同劑量的游離miR-125a對SLE幾乎沒有治療作用。這些結果表明PEAL納米給藥系統大大提高了miR-125a的體內治療效率。此外，研究表明PEAL_miR-125a NPs可以通過逆轉效應/調節T細胞的失衡來恢復SLE小鼠的免疫穩態。所以結果顯示，PEAL_miR-125a NPs為SLE的基因治療提供了一種策略。此外，該制劑在其他以T細胞為主的自身免疫性疾病中具有廣泛的應用前景。

文獻鏈接：MicroRNA-125a-Loaded Polymeric Nanoparticles Alleviate Systemic Lupus Erythematosus by Restoring Effector/Regulatory T Cells Balance (ACS Nano, 2020, DOI: 10.1021/acsnano.9b09998)

課題組簡介：

段友容教授課題組近年來主要致力于藥物遞送系統與轉化醫學領域的研究，探索了多種基于納米技術和生物材料的腫瘤治療新策略。將構建的納米遞送系統應用于腦膠質瘤、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌以及卵巢癌等多種耐藥性腫瘤的靶向治療研究，有一系列原創性研究成果發表（ACS Nano 2016, 10, 11548; Advanced Functional Materials 2018, 28, 1706; Autophagy 2017, 13, 1176; Chemical Engineering Journal 2020, 383, 123230; Biomaterials 2019，222, 119442; Biomaterials 2014, 35, 760; Theranostics 2017, 7, 4424; Theranostics 2019, 9, 1047）。

本文由大兵哥供稿。

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