加拿大麥吉爾大學Mater. Horiz.：響應微孔成型生物打印方法制備多孔粘彈性水凝膠

如何快速地3D打印具有細胞尺寸孔徑的生物支架？現有的生物墨水打印成型后大多會形成納米尺寸孔徑，遠小于細胞的大小，因此往往會阻礙細胞在生物支架內的伸展、遷移、代謝、以及營養物質的輸運。另外，有研究表明具有細胞大小孔徑的支架能促進細胞的功能。因此3D打印具有細胞尺寸孔徑的生物支架，在細胞和組織工程領域具有重要意義。

現有擠出式生物打印技術在打印10微米級別的孔徑捉襟見肘(圖1)。因為傳統的成孔方法（比如凍干處理）沒法實現實時細胞打印，而且10微米級的結構對3D打印精度和速度提出很大的挑戰。這個方向最近成為一個3D打印領域的熱點。新進開發的多孔生物打印方法基于膠束或水相乳液，添加到生物墨水中打印形成多孔結構。這些方法局限于生物墨水的穩定性，導致可打印窗口有限，另外形成的多孔結構的機械強度較低，而且難以調解支架的力學性能（比如粘彈性）。這些問題限制了在生物工程領域的應用。

針對以上問題，加拿大麥吉爾大學李劍宇教授團隊首次提出響應微孔成型生物打印方法（Triggered Micropore-Forming bioprinting），利用水凝膠刺激響應的微分相行為實現新型生物支架的快速制造、力學性能的有效調控，并促進細胞活性和功能。該新型生物打印方法可制造高度聯通且具有細胞大小孔徑的多孔水凝膠，并在低聚合物濃度的條件下首次實現彈性、粘彈性、孔隙三種特性正交調控。

圖1：多種生物材料的孔徑和粘彈性能（應力松弛減半時間）的關系。

該團隊利用殼聚糖pH值從酸性到中性過程中發生微分相的特性來展示TMF打印方法。該生物墨水由負載細胞的殼聚糖（chitosan）和聚乙二醇（PEG）微酸性水溶液組成。其在室溫下打印到控制pH值的明膠嵌入式打印支撐物中后，通過溫度升高到37℃可融化明膠并提升生物墨水的pH值。Chitosan在pH提升到其pKa值（約6.5）之后會發生微分相行為并引發物理交聯形成多孔水凝膠。

圖2：使用TMF方法打印多級孔徑、粘彈性可調生物支架的流程。

研究發現該凝膠的彈性性能可通過嵌入式打印支撐物的pH值調節，其剪切模量（G’）范圍為0.5-27?kPa，橫跨三個數量級。若固定打印支撐物的pH而增加墨水中PEG的含量，凝膠的應力松弛減半時間可從10⁴秒調節到10²秒，同時保持剪切模量不變。在孔徑的表征上，該團隊使用了共聚焦顯微鏡和掃描電鏡兩種方式，同時驗證了這一TMF方法可產生細胞大小孔徑，且孔高度聯通。這一研究首次實現了凝膠的彈性、粘彈性、孔隙三種特性的正交調節。該生物墨水系統具有良好的細胞兼容性，且在厚支架中保持較高的細胞存活率。細胞在多孔凝膠內部的遷移速率也顯著高于非多孔標準凝膠。

圖3：多孔生物支架的機械和結構性能。

該生物墨水在室溫下長期穩定，同時具有良好的流變性能便于擠出式打印。通過改變打印速度和壓強，同一個30G針頭可在120-1500微米范圍內調節線寬。通過不同生物墨水的組合，還可制造出具有粘彈性梯度的多孔凝膠。為了展現TMF打印方法和該生物墨水在生物工程上的應用，研究人員首先打印了由人聲帶成纖維細胞和人氣管上皮細胞組成的復合聲帶結構。其中TMF中的成纖維細胞相比標準墨水更好地在三維環境中展開，上皮細胞也形成了緊密的層狀結構。研究人員還將MDA-MB-231癌細胞打印在具有不同粘彈性的凝膠內進行體外癌癥建模。實驗結果證明癌細胞的增殖和遷移可通過粘彈性調控。該工作對使用多孔凝膠用于組織工程、癌癥模型等生物應用提供新思路。

圖4：生物打印用于軟組織工程和體外癌癥模型的創建。

以上成果發表在RSC旗下Materials Horizons期刊?（Triggered micropore-forming bioprinting of porous viscoelastic hydrogels,?Materials Horizons, 2020, 10.1039/D0MH00813C）。論文的第一作者為加拿大麥吉爾大學機械工程專業博士生鮑光宇。共同通訊作者為麥吉爾大學李劍宇教授和Luc?Mongeau教授，兩人皆為Canada?Research Chair。

本文由作者團隊供稿。