中科院深圳研究院AFM：磷酸鈣礦化黑磷具有顯著提升的抗癌活性和診療應用潛力

【研究背景】

無機納米粒子具有獨特的物理性質，如尺寸、化學性質以及光學/磁性等，因此在腫瘤治療領域得到了廣泛關注。然而，它們固有的化學和生物活性卻被大大低估或忽視。近年來對可生物降解無機納米材料的研究表明，由于降解相關的生物活性，可以通過擾動癌細胞內的離子平衡來調節固有的抗癌活性。作為一類新興的二維納米材料，黑磷納米片（BPs）獨特的抗腫瘤活性源于腫瘤細胞內強烈的氧化應激和能量代謝，加速細胞內降解，導致細胞內磷酸根離子濃度急劇升高，細胞內離子平衡發生劇烈變化。相比之下，BPs對正常細胞具有較好的生物相容性。然而，基于BPs的藥物特異靶向作用機理還不清楚，而且由于BPs表面沒有反應性的有機功能單元，因此BPs的表面功能化對于進一步的應用極具挑戰。

【成果簡介】

近日，中國科學院深圳先進技術研究院喻學鋒研究員與周文華副研究員聯合報道了一種原位磷酸鈣（CaP）礦化策略，以提高黑磷納米片（BPs）的抗癌活性。利用BPs作為磷源和生長模板，合成的CaP礦化BPs（CaBPs）既保留了BPs的固有特性，又對各種熒光素具有很高的負載能力，可以進行有效的生物成像和示蹤。與BPs相比，CaBPs由于改善了癌細胞的pH響應降解行為和細胞內Ca²⁺荷載，顯示出更強的選擇性抗癌活性。此外，CaBPs靶向線粒體并引起結構損傷，從而導致線粒體介導的癌細胞凋亡。靜脈注射后，CaBPs可以靶向原位乳腺癌細胞，顯著抑制腫瘤生長，且不會產生不良反應或毒性。結果表明，CaBPs作為靶向抗癌藥物具有巨大的潛力，同時CaP礦化方法為納米藥物提供了一種多功能的表面功能化策略。該文章近日以題為“Calcium Phosphate Mineralized Black Phosphorous with Enhanced Functionality and Anticancer Bioactivity”發表在知名期刊Adv. Funct. Mater.上，論文共同第一作者是潘婷博士、碩士研究生付文和暨南大學辛洪寶教授。

【圖文導讀】

圖一、CaBPs的表征

（a）CaBPs的合成示意圖。

（b-d）BPs的TEM，AFM以及HR-TEM圖像。

（e-g）CaBPs的TEM，AFM以及HR-TEM圖像。

（h）CaBPs的暗場圖像和元素圖mapping。

（i）BPs和CaBPs的拉曼散射光譜。

（j）CaBPs在不同pH值下的降解速率。

圖二、CaBPs的對熒光素負載和細胞內遞送能力

（a）CaBPs包封FITC過程的示意圖。

（b）FITC/CaBPs釋放FITC的熒光發射光譜（λ_ex = 480nm）（FITC/CaBPs投料比分別為0.4, 1, 2.5 ,5, 7.5, 10）。

（c）不同FITC/CaBPs投料比下CaBPs的FITC負載量（w/w%）。

（d）在PBS溶液中，FITC/CaBPs或FITC/BPs釋放的FITC熒光光譜（FITC/CaBPs投料比為7.5）。

（e-f）用4μg mL^?1 FITC/CaBPs或FITC/BPs處理12小時后MCF-7細胞的CLSM和流式細胞圖像對比。

圖三、CaBPs的特異性抗癌活性

（a）CaBPs與正常細胞hBMSCs和癌細胞MCF-7共孵育24小時和48小時的劑量依賴毒性。

（b）不同劑量下對應的細胞周期分布。

（c）流式細胞術分析CaBPs治療后hBMSCs和MCF-7細胞凋亡。

圖四、CaBPs誘導MCF-7細胞線粒體功能障礙及線粒體介導的凋亡

（a）用JC-1染色評估BPs或CaBPs治療后MMP的變化。

（b）通過熒光ATP檢測分析細胞內ATP水平。

（c）用WB檢測不同濃度CaBPs對MCF-7細胞Bcl-2和Bax表達的影響。

（d）用WB分析不同劑量CaBPs處理的MCF-7細胞釋放細胞色素C（Cyto C）的影響。

（e）不同濃度CaBPs處理MCF-7細胞48h后Caspase 3/7活性。

（f）四個獨立實驗中不同濃度CaBPs處理48h后細胞內GSH水平的變化。

圖五、CaBPs靶向線粒體并引起線粒體結構損傷

（a）CLSM顯示用CaBPs （2μg mL^?1）處理6小時和24小時的MCF-7細胞，DAPI染色的細胞核顯示為藍色，Mito-Tracker染色的線粒體顯示為紅色，綠點代表FITC標記的CABP。

（b）CaBP處理的MCF-7細胞的透射電鏡圖像，其中N代表細胞核，M代表健康線粒體，DM表示線粒體受損。

圖六、MCF-7荷瘤小鼠的體內抗腫瘤作用研究

（a）治療過程示意圖。

（b）小鼠治療結束后腫瘤的照片。

（c）不同處理后荷瘤小鼠的平均腫瘤生長曲線。

（d）從小鼠身上切除的腫瘤重量對比。

（e）治療期間裸鼠的體重變化。

（f）小鼠治療后代表性腫瘤組織的組織學顯微鏡和TUNEL分析圖像。

（g）小鼠治療后主要器官的代表性組織學顯微鏡圖像。

圖七、CaBPs靜脈給藥對原位乳腺癌模型的體內抗腫瘤作用

（a）Cy5.5/CaBPs@PPF注射后不同時間點小鼠的活體熒光圖像。

（b）Cy5.5/CaBPs@PPF注射后不同時間點小鼠不同器官的離體熒光圖像。

（c）（b）中熒光強度的量化對比。

（d）治療過程示意圖。

（e）不同治療組荷瘤小鼠的平均腫瘤生長曲線。

（f）從具有代表性的小鼠身上切除的腫瘤重量。

（g）治療過程中小鼠體重變化。

（h）小鼠治療結束后腫瘤的照片。

（i）治療后小鼠腫瘤組織的TUNEL和H&E染色圖像。

【結論展望】

綜上所述，原位磷酸鈣（CaP）礦化是BPs表面功能化的一種理想的方法，可以顯著提高BPs的抗癌活性和熒光成像。CaP沉積不影響BPs的固有性質和形態，同時增加熒光團的負載能力，以便于生物成像和追蹤。得到的CaBPs比BPs具有更高的抗癌活性，這是由于CaBPs的pH響應性降解增強和細胞內額外的Ca²⁺釋放。此外，CaBPs還可以靶向線粒體，引起線粒體介導的細胞凋亡。體內實驗證實經靜脈注射的CaBPs和PFF修飾的CaBPs確實可以靶向原位乳腺癌細胞，以抑制腫瘤生長，而不會產生不良反應或毒性。CaBPs具有良好的靶向抗癌活性，在腫瘤治療中具有廣闊的應用前景，近一步拓展了活性磷療技術，也為無機活性納米制劑的開發及修飾提供了新思路。

文獻鏈接：Calcium Phosphate Mineralized Black Phosphorous with Enhanced Functionality and Anticancer Bioactivity (Adv. Funct. Mater. 2020, 2003069)

課題組簡介：

喻學鋒，1996-2008年先后獲得武漢大學物理學學士、微電子學與固體電子學碩士、光學博士學位；2003年碩士畢業留校任教，歷任武漢大學物理科學與技術學院助教、講師、副教授，獲珞珈青年學者；2012-2013年赴香港城市大學等離子體實驗室工作，擔任高級副研究員；2014年至今在中國科學院深圳先進技術研究院工作，擔任研究員/博士生導師；2016年創立了材料界面研究中心，擔任中心主任；2017年任命為院材料/化學學科組副組長；2019年起擔任為院材料科學與工程研究所副所長、深圳電子材料國際創新院副院長。近五年承擔各級縱向科研項目10多項，包括國家自然科學基金面上項目（3項）、國家973子課題、中科院前沿重點研究項目、中科院STS項目、深圳市基礎研究布局項目、深圳市工程中心等，累計獲批科研經費5000余萬元；獲企業橫向科研項目4項，經費累計3200余萬元。近五年以通訊作者發表JCR一區 SCI 論文51篇，其中影響因子大于10的有34篇，16篇論文被選為期刊封面論文。論文共被引用7200余次，14篇論文先后入選ESI高被引論文。

課題組主頁：中國科學院深圳先進技術研究院材料界面研究中心

周文華，中科院深圳先進技術研究院副研究員，2005年獲得中山生命科學學士學位，2006年-2012年先后獲得英國倫敦帝國理工學院生物醫學工程/生物醫學研究雙碩士和生物醫藥博士學位，2012-2015年在英國倫敦帝國理工學院國家心肺研究所完成博士后研究，2015年至今在中國科學院深圳先進技術研究院工作。主要研究方向有：1、生物分子的高敏檢測分析（單分子熒光檢測技術）；2、基于CRISPR基因編輯體系的新型診療技術開發（新型CRISPR轉運平臺、基于CRISPR等溫擴增技術的生物芯片等）；3、納米材料的生物學功能及應用（納米材料的生物活性機理、智能納米載體等）。近五年承擔各級縱向科研項目3項，包括英國心臟基金會項目、國家自然科學基金青年基金項目、深圳市國際合作項目累計獲批科研經費300余萬元；獲企業橫向科研項目1項，經費累計100萬元。目前該團隊擁有來自材料、電子、物理、化學、生物、工程等多學科領域科研人員15人。共發表 SCI 論文20余篇，其中影響因子>10的第一作者論文有3篇。

課題組主頁：CRISPR生物芯片團隊

本文由大兵哥供稿。

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