浙大 ACS Nano：180度大反轉！改變自噬作用提高對乏氧腫瘤的光動力治療

【背景介紹】

光動力治療（PDT）是一種用于許多局部和表面疾病的非侵襲治療新方法。在PDT過程中，會產生具有細胞毒性的活性氧（ROS）來誘導細胞凋亡。同時，ROS也是自噬的重要誘因。其實，自噬是一種分解代謝過程，通過溶酶體途徑降解功能失調或有害的細胞器和蛋白質。但是，過度的激活自噬會導致自噬細胞死亡。因此，自噬與細胞凋亡之間的串擾對PDT的治療效果有重要影響。然而，利用自噬抑制劑來完全抑制自噬非常困難。因此，合理設計納米材料來調控自噬從促生存變成促死亡，將是PDT中一個有意義的研究方向。眾所周知，缺氧是許多實體瘤的顯著特征。因此，如何緩解腫瘤缺氧是PDT的重中之重。目前，大多數研究集中在通過將H₂O₂分解為O₂或直接輸送O₂來增加O₂的供應。其實，通過減少生理O₂的消耗也是一種緩解腫瘤缺氧的方法。但是，如何通過抑制O₂的消耗來緩解腫瘤缺氧的方法仍未得到充分的探索。

【成果簡介】

近日，浙江大學的金橋副教授（通訊作者）和計劍教授等人報道了一種新型的超分子納米平臺，通過將自噬的作用從促進生存轉變為促進死亡來增強PDT。利用呼吸抑制劑3-溴丙酮酸（3BP）作為自噬啟動因子和缺氧改善劑，將其整合到光敏劑Chlorin e6（Ce6）包裹的納米顆粒中，以對抗缺氧腫瘤。其中，3BP通過下調HK-II和GAPDH的表達來抑制呼吸作用，從而顯著降低細胞內耗氧率，以減輕腫瘤的缺氧而增強PDT。更重要的是，通過Western印跡、免疫熒光成像和透射電子顯微鏡（TEM）測定，發現3BP和PDT的結合顯著提高了自噬的水平。過度激活的自噬作用促進了細胞的凋亡，因此結合3BP的PDT可以有效抑制細胞增殖，同時殺死腫瘤。此外，通過3BP減輕腫瘤缺氧后，可降低缺氧誘導因子1α（HIF-1α）的表達，進而通過消除原發腫瘤和下調HIF-1α表達來有效抑制腫瘤的轉移。總之，這些結果為未來的癌癥治療創新方法提供了新思路。研究成果以題為“3-Bromopyruvate-Conjugated Nanoplatform-Induced Pro-Death Autophagy for Enhanced Photodynamic Therapy against Hypoxic Tumor”發布在國際著名期刊ACS Nano上。

【圖文解讀】

圖一、CD-Ce6-3BP NPs和CD-Ce6 NPs的表征
（A）具有不同質量比的3BP與Ce6的CD-Ce6-3BP NPs的粒徑尺寸；

（B）CD-Ce6-3BP NPs和CD-Ce6 NPs的Dh和TEM圖像；

（C）在儲存10 d期間，PBS緩沖液中不同納米顆粒的Dh；

（D）利用660 nm照射處理或pH=5.5溶液處理4 h后，CD-Ce6-3BP NPs的D_h變化。

圖二、糖酵解抑制、O₂消耗減少和CD-Ce6-3BP NPs的體外細胞毒性促進作用
（A）KB細胞與不同處理孵育6 h后，Western blot檢測HK-II、GAPDH和HIF-1α的水平；

（B）KB細胞與不同處理孵育6 h后，定量分析HK-Ⅱ的相對表達；

（C）KB細胞與不同處理孵育6 h后，定量分析GAPDH的相對表達；

（D）KB細胞與CD-Ce6 NPs或CD-Ce6-3BP NPs孵育6 h后，細胞內乳酸水平；

（E）KB細胞與CD-Ce6 NPs或CD-Ce6-3BP NPs孵育6 h后，細胞內ATP水平；

（F）用不同處理孵育6 h后，KB細胞的耗氧量；

（G）KB細胞與不同處理孵育6 h后，定量分析HIF-1α的相對表達；

（H）用CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CD-Ce6 NPs/L、CD-Ce6-3BP NPs/L、游離3BP或CD-3BP處理后，KB細胞的存活率；

（I）不同處理后，利用熒光探針檢測的細胞毒性。

圖三、CD-Ce6-3BP NPs的自噬作用促進細胞死亡
（A）CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CD-Ce6 NPs/L、CD-Ce6-3BP NPs/L、游離3BP或CD-3BP處理KB細胞6 h后，Western blot 檢測LC3-I、LC3-II和p62的水平；

（B）不同處理后，定量分析LC3-II/LC3-I；

（C）不同處理后，定量分析p62的相對表達；

（D）有無激光照射1 min的情況下，用CD-Ce6 NPs或CD-Ce6-3BP NPs處理KB細胞4 h后，代表性LC3點狀點的免疫熒光圖像；

（E）有無激光照射1 min的情況下，用CD-Ce6 NPs或CD-Ce6-3BP NPs處理KB細胞4 h后，MDC染色的熒光圖像；

（F）有無激光照射1 min的情況下，用CD-Ce6 NPs或CD-Ce6-3BP NPs處理KB細胞4 h后，形成自噬體的TEM圖；

（G）（F）中放大倍數的TEM圖像；

（H）在存在RAPA或3-MA的情況下，用CD-Ce6 NPs/L或CD-Ce6-3BP NPs/L處理后，KB細胞的存活率；

（I）不同處理后，利用熒光探針檢測的細胞毒性。

圖四、CD-Ce6-3BP NPs增加凋亡水平
（A）用CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CD-Ce6 NPs/L、CDCe6-3BP NPs/L、游離3BP或CD-3BP處理KB細胞6 h后，Western blot檢測caspase 3的表達；

（B）利用Annexin V-FITC和PI分析法對CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CD-Ce6 NPs/L或CD-Ce6-3BP NPs/L處理KB細胞后，對凋亡細胞進行流式細胞術分析。

圖五、對皮下腫瘤進行體內抗腫瘤、自噬和凋亡水平評估
（A）游離Ce6、CD-Ce6和CD-Ce6-3BP NPs的藥代動力學特征；

（B）缺氧和血管染色后腫瘤切片的代表性免疫熒光圖像；

（C）CD-Ce6 NPs或CD-Ce6-3BP NPs處理后，Western blot檢測小鼠腫瘤組織中HIF-1α的水平；

（D）根據（C）的小鼠腫瘤組織，定量分析HIF-1α的相對表達；

（E）KB皮下腫瘤接種、給藥治療方案示意圖；

（F）PBS、CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CDCe6 NPs/L和CD-Ce6-3BP NPs/L處理后，帶有皮下KB腫瘤的裸鼠的腫瘤生長曲線；

（G）每只患有皮下KB腫瘤的小鼠的腫瘤重量；

（H）不同處理后，Western blot檢測小鼠腫瘤組織中LC3-Ⅰ、LC3-II、p62和caspase 3的水平；

（I）PBS、CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CD-Ce6 NPs/L和CDCe6-3BP NPs/L處理后，小鼠腫瘤組織中LC3的代表性免疫熒光圖像。

圖六、原位4T1乳腺癌的治療及其對肺轉移的抑制作用
（A）肺轉移治療4T1原位乳腺腫瘤的接種和給藥治療方案示意圖；

（B）PBS、CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CD-Ce6 NPs/L和CD-Ce6-3BP NPs/L處理KB腫瘤裸鼠后的腫瘤生長曲線；

（C）每只患有原位4T1乳腺腫瘤的小鼠的腫瘤重量；

（D）注射后21 d后，從小鼠收獲的原位腫瘤的腫瘤圖像；

（E）4T1肺轉移小鼠的生物發光成像照片；

（F）處理21 d后，肺部的生物發光成像照片；

（G）各組肺的生物發光強度；

（H）每組肺表面上存在的腫瘤結節的數目；

（I）各組肺中的腫瘤覆蓋率；

（J）從各組切下的肺的代表性圖像；

（K）H＆E染色后，各組肺組織轉移灶的組織學檢查。

圖七、基因表達分析
（A）全基因表達的熱圖；

（B）與自噬表達相關的15個關鍵基因分析的熱圖；

（C）與凋亡表達相關的15個關鍵基因分析的熱圖。

【小結】

綜上所述，作者開發了一種通過過渡激活自噬作用來克服PDT中的不足。利用呼吸抑制劑3BP來誘導過度自噬而將自噬作用從促生存轉變為促死亡，從而提高治療效果。通過LC3-/LC3-比率的增加和p62表達的下調，證明了3BP和PDT聯合處理可顯著增加自噬水平。而且，在通過降低HK-和GAPDH的表達來抑制糖酵解方面，3BP與真正的糖酵解抑制劑2DG相當。此外，通過控制3BP和Ce6的進料比，可以容易地調控3BP和Ce6的組成。此外，利用含3BP的納米平臺可減少O₂消耗來緩解腫瘤缺氧。在激光照射下，用CD-Ce6-3BP NPs治療后，可以有效抑制細胞增殖和腫瘤生長。同時，3BP和PDT的結合可以通過消除原發腫瘤和下調HIF-1α表達來有效抑制腫瘤轉移。總之，該研究不僅為緩解PDT中的腫瘤缺氧提供了一種簡單的方法，而且對未來的癌癥治療創新方法提供了新思路。

文獻鏈接：3-Bromopyruvate-Conjugated Nanoplatform-Induced Pro-Death Autophagy for Enhanced Photodynamic Therapy against Hypoxic Tumor（ACS Nano, 2020, DOI: 10.1021/acsnano.0c01350）

本文由CQR編譯。

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