Nat. Nanotech.：基于基因刷模式和二維隔室幾何結構的多蛋白組裝設計

【研究背景】

在自然界中，具有分子機器功能的蛋白質復合物十分常見，這為自下而上的制造以及開發由生物相容性材料制備的柔性機器人提供了新的機遇。細胞中蛋白質部分的合成是由化學能消耗驅動的基因調控反應發生的。蛋白質復合物以低維自組裝，局限于亞細胞器中的微小體積，或局限于流動性降低和相互作用增強的內表面。蛋白質合成過程中可能會發生組裝，受到操縱子和簇中基因的空間組織、核糖體和mRNA定位到特定細胞靶點以及擁擠的細胞質的影響。已經證實，基因在一鍋溶液反應中無細胞合成蛋白質，并將其組裝成功能性機器，但這些系統缺乏空間組織和限制。除了大量溶液實驗外，使用表面固定DNA模板進行蛋白質合成增加了反應的空間成分。密集的DNA結合在表面形成一個基因刷，定位RNA和蛋白質產物的合成。在表面捕獲產物進一步創造了一個局部的基因型-表型連鎖，并支持多蛋白機器組裝，然而產物在沒有物理邊界的情況下稀釋成大體積反應溶液。

【成果簡介】

近日，以色列魏茨曼科學研究所Shirley S. Daube教授與Roy H. Bar-Ziv教授聯合展示了準二維（2D）硅室，它可以通過表面固定DNA刷的局部合成來編程蛋白質裝配線。利用該平臺，作者研究了由噬菌體和細菌RNA合成機自動合成和組裝結構復合物的過程。配合物的局部合成和表面捕獲提供了高的組裝產率和對空間分辨的組裝中間體的靈敏檢測，而腔室的三維幾何結構和二維模式決定了組裝步驟的產量和方式。蛋白質在單個基因刷中的局部合成增強了它們之間的相互作用，它們的基因在分離刷中的位移導致了逐步的表面組裝。這種方法使蛋白質合成的空間調控，以及生物機器裝配線的破譯、重建和設計成為可能。該文章近日以題為“Programming multi-protein assembly by gene-brush patterns and two-dimensional compartment geometry”發表在知名期刊Nature Nanotechnology上。

【圖文導讀】

圖一、二維隔室中的蛋白質合成與組裝

（a）二維硅室陣列的圖像和示意圖。

（b）T7RNAPs（淺灰色）和核糖體（深灰色）定位于DNA刷并表達楔形蛋白（棕色），這些蛋白按順序組裝并與表面抗體上的gp11（淺棕色）結合示意圖。

（c）基因-10片段可變的四個隔間，以及固定基因6、7和8。

（d）后染色方案的順序與組裝路徑。

（e）分別滴定的在不同基因部分形成的楔形物的標準化劑量響應曲線。

（f）GFP和楔形物根據其基因片段在DNA刷中的基因分數而捕獲，并由可表達的非相關基因補充。

圖二、一維隔室的溶液組裝和表面支架

（a）長軸上有基因10和7的刷狀雙倍體的矩形隔間的圖像和示意圖。

（b）gp10和gp7的解決方案和支架組裝示意圖。

（c）帶有gene-10和gene-7刷子的隔間圖像。

（d）隨著基因-10和基因-7刷之間距離的增加，gp10-7（紅色）和占據位點（綠色）的分布。

（e）在（c）中實驗和模擬的gp10-7復合物的總數。

（f）在兩種基因比率（1:1和3:1）下，在混合刷或500μm分離條件下，gp10-7組裝產量的計算機模擬。

圖三、基因刷分布對楔形組裝的影響

（a）分別用FL-gp8、FL-gp6和FL-gp53后染色的gp10-7復合體（左）、預楔子（中）和楔體（右）的后染色隔間圖像。

（b）從混合（（i），（ii），（iii）），分離（（iv），（v），（vi））和展開（（vii），（viii），（ix））基因刷染色的楔子和中間產物的27個剖面。

（c）用FL-gp53后染色的楔形體，其基因-8（左）或基因-6（右）從其余楔形基因中移位。

（d）作為基因-10和基因-8或基因-6之間的刷間距離的函數，在c的整個隔室中整合的楔形物。

圖四、解密裝配順序

（a）在片上反應過程中，用FL-gp8原位標記的隔室圖像（紅色）。

（b）三種不同的FL蛋白和五種不同HA蛋白的所有組合在（a）中的白色虛線框中紅色信號的積分。

（c）用FL-gp8和（b）中選擇的HA-gp11原位標記楔形剖面的圖像，用白色圓圈標記楔形基因的分離刷，在每個間隔中刪除不同的刷。

（d）整體楔形剖面圖，用FL-gp8（頂部）和FL-gp10（底部）進行原位標記。

圖五、基因組成和隔室幾何結構對大腸桿菌RNAP組裝的影響

（a）大腸桿菌RNAP核心酶和σ70亞基（在T7啟動子控制下）的合成、組裝和活性的級聯反應示意圖。

（b）GFP信號在深2 μm（空圈）和20 μm（深圈）隔室中作為DNA刷中σ70基因分數的函數。

（c）HA-GFP信號在整個隔室表面，可變隔室半徑（100-300 μm）和深度（2 μm和20 μm）處的積分。

圖六、資源分配對基因表達的局部調控

（a-c）在具有刷子分布（混合（i）、分離（ii）和展開（iii））的隔間中的總GFP信號（a），以及定義的基因顏色編碼（c）。在2 μm深和20 μm深的刷子分布的隔間內的局部GFP信號（b）。

（d-e）GFP信號（d），集成在五個相同的刷子（e中各自代表性圖像中的1-5）周圍，并根據1周圍的信號進行歸一化。

【結論展望】

研究結果表明范例從無細胞反應轉變為有限的準二維表面定位反應，能夠進行基因組規模的合成、高效且可調節的組裝、蛋白質簇的捕獲以及資源分配，從而促進了級聯反應的高產量。亞毫米級的基因布局和隔室的幾何形狀可調諧納米級蛋白質裝配產量。同時作者還發現，在刷子附近的耦合合成和組裝增強了順序組裝步驟的弱相互作用，而表面支架組裝通過消除競爭性相互作用而增強了非順序組裝步驟。基因模式可以區別性地沉默，否則相同的遺傳調節單位和原位標記方法可用于破譯組裝順序。表面輪廓未來可能會通過高分辨率成像方法用于表征裝配中間產物。

文獻鏈接：Programming multi-protein assembly by gene-brush patterns and two-dimensional compartment geometry (Nature Nanotechnology, 2020, DOI: 10.1038/s41565-020-0720-7)

本文由大兵哥供稿。

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