跟著頂刊學測試｜原子力顯微鏡：探尋力與蛋白質等電點的糾葛

等電點（pI）是表面和分子的一種固有性質，被定義為實體攜帶零凈電荷的pH值。pI對蛋白質特別重要，因為它與分離科學、醫藥應用、傳感和非特異性吸附(污垢)有關，而pI的值受氨基酸組成、化學側鏈修飾和三維構象的影響。目前采用的測量方法需要高濃度的已知蛋白質溶液，這就大大限制了蛋白質pI的測量。因此本文的作者在Nature?Technology雜志上就介紹了一種基于微量蛋白質結合原子力顯微鏡(AFM)力譜學檢測蛋白質pI的方法。該方法中，最重要的一個測量工具就是蛋白質共價連接到功能化原子力顯微鏡(AFM)膠體探針，可用于測量已知表面電荷的蛋白質與相對PH值的AFM力譜之間的相互作用，進而直接提供未知蛋白質在一個廣泛的pH值范圍(4-11) 的pI值。 AFM是一種敏感和通用的技術，可用于評估固定在尖端和固體基質表面的相互作用大分子(例如蛋白質)之間的力-距離關系。蛋白質和固體基質表面之間的黏附力可以通過縮回在固體表面的蛋白質固定AFM探針來量化，與此同時，自組裝單分子膜與底物之間的黏附力隨溶液pH值和離子強度發生相應的變化，因此就可以利用AFM測量蛋白質在不同PH值中的黏附力來確定蛋白質的pI。

首先，制備蛋白質固化的功能化AFM探針和不同PH值顯示不同表面電荷的固體基質；然后將在明確PH下測得的黏附力大小與PH值之間的轉化特征定義為蛋白質的pI。其中最重要的固體基底是利用各方面條件都非常穩定的靜電聚合電解質由層對層（LbL）沉積方法制備而成，采用的靜電聚合電解質主要有聚(異丁烯-馬來酸酐)(P1)和工業的聚乙烯亞胺 (PEI)（圖1a）。固體基底表面的電位則是通過調節基底沉積過程中使用的浸漬液的PH值來實現。因此，本文主要制備了PH值在4以上的帶負電的LbL₄基底和PH值在11以下的帶正電的LbL₁₁基底來保證一個比較穩定的測試條件（圖1b）。

其次，利用原子力顯微鏡AFM測量蛋白質共價連接的功能化探針與設計表面之間的拉力作為PH值的函數來估算蛋白質的pI值（圖1c）。選用四個已知pI值的牛血清白蛋白(BSA)，肌紅蛋白，牛血漿纖維蛋白原(纖維蛋白原)和核糖核酸酶A(RNase A)經蛋白結合劑戊二醛與探針穩定共價附著，隨后反復測量不同表面區域的固體基底來探測更大的截面。以肌紅蛋白為例，隨著PH值的變化，蛋白質修飾探針與固體基底表面之間的力距離曲線圖中可以看到，調節AFM實驗中電解質的pH值時，LbL₄和LbL₁₁的黏附力有顯著差異。在pH值為7-8時，LbL₄記錄到了低黏附力曲線，這意味著肌紅蛋白對表面的親和力較低，而當pH值降低到6.5或更低時，黏附力顯著增加(圖1d)。

隨后觀察到的典型鋸齒狀拉力曲線表明，在探針分離過程中蛋白質和表面之間存在多種相互作用。然而，當單個樣品在經過大約100個方法測試之后，其數據顯示測得的力值有良好的再現性與較低的標準偏差(圖2)。這表明不可逆的蛋白質表面相互作用在討論的實驗中并沒有發揮關鍵的作用。圖2a中的黏附力數據(肌紅蛋白)清晰地表明，在低pH值時，帶負電荷的表面和帶正電荷的肌紅蛋白之間存在靜電吸引。在pH值為7.0-8.0范圍內觀察到相對較低的粘附力(0.25±0.07 nN)，這可歸因于蛋白質和表面之間的其他非庫侖相互作用。通過觀察相互作用力的閾值，我們可以得出肌紅蛋白的pI值在6.5-7.0范圍內的結論。

在LbL₁₁模型帶正電荷表面的實驗中，則觀察到相反的黏附現象(圖1d)。當pH值為8.0時，蛋白質黏附力(0.70±0.08 nN)最強，隨著pH值的降低，黏附力逐漸降低(圖1d(右))。除此之外，在pH值6.5-7.0范圍內再次檢測到黏附力的階梯變化。當pH值低于6.5時，黏附力仍然很低，這表明蛋白質和帶正電荷的表面之間的相互作用是非庫侖性的。因此本實驗證實了，當pH值在6.5-7.0范圍內時，蛋白質的凈電荷由負變為正，越過pI點(圖2a)。

接下來，繼續用BSA、纖維蛋白原和RNase A蛋白裝飾的探針也進行了類似的實驗(圖2b-d)。通過分析不同PH值下不同蛋白質與帶負電(LbL₄)和帶正電的(LbL₁₁)表面黏附力曲線的直方圖，可以得出BSA，纖維蛋白原，肌紅蛋白和RNase A的pI值與表1中的文獻已知蛋白質pI值相符合。模型蛋白從低pI (BSA)到高pI (RNase A)，隨著pH值的改變，黏附力發生突變。過渡階段發生在一個狹窄的pH范圍內，通常不超過0.5 個pH單位。黏附力的強度與實驗的pH值的對照圖(圖2)表明，當蛋白質和表面攜帶相反的電荷時，靜電力主導相互作用。當越過pI值并獲得相同的蛋白質和底物電荷符號時，在所有實驗中均可觀察到低黏附力水平下的非庫侖相互作用。以上結果表明，基于AFM的方法是檢測蛋白pI值的可靠方法。根據AFM的敏感性，我們可以推測，進一步細化和調整pH尺度后，可以更準確地估計蛋白的pI范圍。

此外，作者以pH =4.2時BSA修飾探針與LbL₄之間的粘附力為例(圖2b)，以估算有助于黏附力分離的BSA蛋白的數量。檢測到的BSA粘著力值為1 nN(圖2b)，因此估計界面張力值為0.4 mJ m^-2。根據Hertz模型, 在pH=4.2時LbL₄表面的復合彈性常數K估計為5?mpa。因此，將零電荷時的接觸半徑a₀估計為72 nm，將拉回時的接觸半徑a_s估計為45.5 nm。據報道BSA的蛋白半徑為2.1 nm，這相當于在探針拉回事件中大約有470個蛋白質相互作用。這個估算證明了該方法的威力，因為作者只使用幾百個蛋白質分子就可以完成在pI值的預估。

最后，一步一步的驗證下來之后，接下來就是利用以上驗證過的功能化AFM設備來檢測一個未知pI值的蛋白質物種來進行實踐檢驗真理了。作者選用了一個與粘附力相關性非常高的藤壺幼蟲蛋白來進行試驗。為了探究藤壺幼蟲蛋白的pI，作者先按照之前的方法先將蛋白固定在戊二醛功能化的AFM探針上，隨后使用這種改良的探針，在LbL₄和LbL₁₁的表面，測量不同pH值溶液中幼蟲蛋白與表面之間的黏附力。在帶負電荷的LbL₄表面， pH=10.5時測得的黏附力較低，在9.7-10.5的pH范圍內黏附力無顯著差異(圖3b)。然而，當pH值從9.7降低到9.6時，黏附力顯著增加，并且隨著pH值的降低，黏附力進一步增加。在pH值為8.5時觀察到最強的黏附力，其值為1.7±0.3 nN(圖3b)。在帶正電荷的表面(LbL₁₁)上進行的實驗表明，在8.5-9.6的pH值范圍內，測得的黏附力較低且在此范圍內，黏附力無顯著變化差異(圖3d)。當pH值從9.6增加到9.7時，黏附力沒有顯著提高，在pH=10.5時黏附力最高，為1.27±0.18 nN。從這些數據可以推斷，藤壺幼蟲蛋白在pH值為8.5-9.6范圍內帶正電荷，所表現的低黏附力主要歸因于非庫侖相互作用。相比之下，這些蛋白在pH值為9.7-10.5范圍內攜帶總電荷為負電荷。根據以上觀察，作者得出的結論是，藤壺幼蟲蛋白的pI位于9.6-9.7范圍內。由于海水的pH值通常在7.8-8.3之間，由以上結果表明藤壺幼蟲蛋白在海水中攜帶凈正電荷。作者進一步推測，由于海洋的自然表面覆蓋著帶負電荷的生物膜和懸浮物，因此藤壺幼蟲蛋白較高的pI值與其黏附功能相一致。綜上所述，作者探索得出的新型功能化AFM實驗檢測蛋白質的pI值優點非常明顯，即蛋白質的用量非常小，僅用470個蛋白質分子固定在探針上就可以與表面相互作用從而測定蛋白質的pI值。

參考文獻：Guo, S., Zhu, X., Jańczewski, D., Lee, S. S. C., He, T., Teo, S. L. M., & Vancso, G. J. (2016). Measuring protein isoelectric points by AFM-based force spectroscopy using trace amounts of sample.?Nature nanotechnology?,?11?(9), 817-823.

文章來源：https://www.nature.com/articles/nnano.2016.118

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