清華李艷梅&中科院深圳先進院喻學鋒Biomaterials：黑磷納米片作為免疫增強納米佐劑及其近紅外光促進的免疫治療

引言

腫瘤免疫治療利用患者的免疫系統殺傷或根除腫瘤，是克服癌癥轉移和復發的重要臨床手段。作為近年來快速發展的一種主動型療法，治療性癌癥疫苗通過整合抗原和免疫佐劑，有望增強抗原免疫原性，并協調先天和適應性免疫系統產生腫瘤特異性應答。利用納米體系調控疫苗的生理命運提高了免疫應答的方向性和精確性，發展更為有效和可控的治療方法，如納米疫苗設計與應用。而納米材料的井噴式發展促進了相關疫苗體系設計的多樣性和復雜性，有助于改進疫苗安全性和效力。不僅如此，一些納米材料與體內免疫系統相互作用后會誘發免疫激活效應，如提高抗原呈遞細胞（APC）的成熟、活化以及抗原展示等，這進一步促進了基于納米材料所固有的免疫性質開發與應用，如納米佐劑。盡管一些研究報道了納米材料的佐劑性質和應用前景，但是人們仍然渴求一種集強大的佐劑性、優異的生物相容性、生物降解性和多種免疫增強機制于一體的理想型佐劑，其有望進一步擴充并優化相關免疫治療。

成果簡介

近日，在清華大學李艷梅教授和中科院深圳先進技術研究院喻學鋒研究員帶領下，研究團隊深入研究了黑磷納米片（BPs）的納米佐劑性質和治療應用前景。團隊篩選得到的苯丙氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸（FKF）片段可提升其共價修飾的抗原肽（OVAp）與BP的高效負載。其組裝復合物FKF-OVAp@BP構成了一種極簡的疫苗體系，無需添加額外組分，BP能夠增強樹突細胞（DC）的成熟、抗原攝取-釋放-抗原呈遞以及淋巴運輸。系統性皮下免疫可顯著增強小鼠脾臟與腫瘤內的抗原特異性CD8⁺?T細胞的活化與殺傷，進一步抑制腫瘤生長并延長小鼠存活率。瘤內原位免疫同樣能夠產生特異性的抗腫瘤應答；同時，BP的高效光熱轉化性質可實現近紅外(NIR)介導的原位溫和熱生成，促進腫瘤免疫抑制微環境的改善，如提高活化DC的比例和增強T細胞效應性等。此外，光熱促進下的瘤內原位免疫也大大提高了脾臟中記憶細胞應答，促進了長效的免疫監查。NIR促進的BP納米疫苗進一步協同免疫檢查點阻斷療法（anti-PD-L1單抗）實現強力的治療作用，具有重要的臨床應用價值。該工作探究了整合型、多功能化納米佐劑材料可用于簡化但高效的納米免疫治療，為之后的納米佐劑拓展提供了重要基礎和合理方案。該成果以題為“Black phosphorous nanosheet: A novel immune-potentiating nanoadjuvant for near-infrared-improved immunotherapy”發表在生物材料領域頂級期刊Biomaterials上。論文第一作者為清華大學化學系的博士生李文浩。

圖文導讀

Scheme?1. 黑磷納米片(BPs)可作為一種新型的納米佐劑材料用于疫苗設計

a）系統免疫的BP納米疫苗可觸發一系列抗原特異性免疫反應，其與免疫檢查點抑制劑協同促進腫瘤治療。

b）局部免疫的BP納米疫苗可利用BP介導的NIR效應產生溫和的局部熱，優化瘤內免疫啟動并促進系統性T細胞增殖，并增強腫瘤免疫治療。

Figure?1. 黑磷納米片(BPs)可作為一種高效的抗原負載平臺

a）FKF-OVAp@BP的制備流程及BP負載片段篩選示意圖

b）HPLC測定不同修飾的抗原肽在BP負載前后上清的含量

c）FKF-OVAp@BP的透射電子顯微鏡圖

d）FKF-OVAp@BP的原子力顯微鏡圖

e）HPLC定量FKF-OVAp在BP上的負載量

f）BP負載前后的紅外可見吸收光譜

Figure?2. BP促進抗原攝取以及未成熟骨髓來源樹突細胞（BMDC）的廣泛免疫激活

a）流式細胞術分析BMDC對BP負載前后的熒光標記抗原肽（TMR-FKF-OVAp）的攝取

b）共聚焦顯微圖片展示TMR-FKF-OVAp在BMDC中的定位及含量

c）抗原肽-組織相容性復合物在BMDC中的呈遞情況

d）呈遞抗原的BMDC的比例

e）BP處理前后BMDC表面的活化標志物變化及分析

f-h）ELISA測定BP與BMDC孵育24 h后上清的細胞因子含量：f）TNF-α，g）IL-12p70，h）IL-1β

Figure?3. BP是一種雙效平臺，不僅優化抗原遞送，并且激活細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應

a-b）小鼠活體熒光成像（IVIS）測定BP作用下抗原的淋巴運輸及其定量

c-f）小鼠皮下注射的48 h后，淋巴結內功能型DC含量分析：c）呈遞抗原的DC，d）活化的DC，e）淋巴遷移型DC，f）呈遞抗原的遷移型DC

g）小鼠的免疫流程

h-i）抗原特異性CD8⁺?T細胞水平變化及定量分析

j-l）脾臟內免疫細胞水平變化：j）CD8⁺ T細胞，k）活化的DC，l）DC的含量變化

m-n）ELISPOT測定抗原再刺激后脾臟細胞的抗原特異性響應及定量統計

o）抗原再刺激后脾細胞的增殖情況

Figure?4. BP納米疫苗可誘發系統性的抗腫瘤免疫

a）B16-OVA荷瘤小鼠的免疫流程

b）不同實驗組的小鼠腫瘤生長曲線

c）不同實驗組的小鼠生存曲線

d）小鼠脾臟內CD8⁺?T細胞中的CD69⁺?CD8⁺?T細胞的比例

e-f）抗原再刺激后小鼠脾臟中IFN-γ⁺?CD8⁺?T細胞變化及定量分析

g-h）抗原再刺激后小鼠腫瘤中IFN-γ⁺?CD8⁺?T細胞變化及定量分析

i-k）ELISA測定荷瘤小鼠血清中細胞因子含量：i）IL-2，j）TNF-α，k）TGF-β

Figure?5. NIR介導的溫和光熱促進BP納米疫苗的腫瘤免疫治療

a）紅外成像儀測定體外PBS溶液中FKF-OVAp@BP的光熱變化

b）B16-OVA荷瘤小鼠的光熱及聯合療法流程示意

c）不同實驗組的活體紅外成像

d）不同實驗組的小鼠腫瘤生長曲線

e）不同實驗組的小鼠生存曲線

f）免疫后小鼠腫瘤組織切片的H&E染色圖

g）腫瘤浸潤APC中活化巨噬細胞（MΦ）和活化DC的比例

h）腫瘤內效應性CD8⁺?T細胞（T_eff）與調節性CD4⁺?T細胞（T_reg）的比例變化

i）脾臟內CD8⁺?T中效應記憶型T細胞（T_em）和中央記憶型T細胞（T_cm）的含量

j-k）ELISPOT測定光熱及聯合療法治療后小鼠脾臟內抗原特異性T細胞變化及定量

小結

綜上所述，研究團隊對BP的多種免疫增效性質進行探究：1）利用BP的表面化學物理性質實現抗原組合，2）探究BP本身佐劑性質，實現極簡疫苗設計與抗腫瘤療法應用，3）挖掘并利用BP固有的化學物理性質（如光熱性質），探究其對免疫抑制微環境的改善和治療輔助。研究工作實現了一體化、多功能的佐劑，不僅促進了人們對BP的佐劑功能理解，同時為后續開發整合型、多功能化的新型納米佐劑材料提供了重要基礎和合理方案。

原文信息：Wen-Hao Li, Jun-Jun Wu, Lie Wu, Bo-Dou Zhang, Hong-Guo Hu, Lang Zhao, Zhi-Bin Li, Xue-Feng Yu*, Yan-Mei Li*. Black phosphorous nanosheet: A novel immune-potentiating nanoadjuvant for near-infrared-improved immunotherapy. Biomaterials?2021, DOI:?10.1016/j.biomaterials.2021.120788

鏈接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120788

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