世界性病毒傳播的快速檢測 有可能被這種新材料解決嗎？

1. 前言介紹

病毒是一種由蛋白質外殼中的核酸分子組成的亞顯微感染因子。這種結構上的簡單意味著病毒不能自己復制，必須滲透并隔離活細胞的繁殖機制來進行自身的繁殖。病毒顆粒是導致諸如水痘、流感、SARS、埃博拉、獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病)等大量疾病的原因。一般來說，病毒顆粒的小尺寸(通常從20到900 nm)使它們難以分離。此外，它們的結構簡單性賦予了快速的自發適應和進化，這可能通過直接的基因突變、基因替換或重組來實現。

病毒引起的病理學實驗室診斷在疫情應對工作和建立安全、快速的檢測策略方面發揮著關鍵作用。使用商業解決方案檢測致病病毒需要特定的工具和費力的實驗室程序。這使得每天按時檢測病毒感染成為任何疫情的限制步驟。因此人們迫切需要新的診斷工具，這些工具快速提供給衛生基礎設施和訓練有素的人員稀缺的貧困和農村欠發達地區。金屬-有機框架（MOF）廣為人知的內在特性有可能克服病毒檢測固有的一些挑戰。MOF 已經是功能性器件的組成部分，能夠實現不間斷地檢測分子靶標。在這里我們總結了關于用作致病病毒傳感器的MOFs的研究報道。

2. MOFs在病毒感染檢測中的應用

MOFs體現了固有特性的獨特組合，使其成為分子識別和生物傳感應用的優秀候選材料:高孔隙率、大表面積、高結晶度、開放的結構、易于調節的化學組成，并且它們可以通過合成后功能化的形式以多種方式進行改性。此外，還發現許多MOFs具有較低的細胞毒性，是生物分子固定和保護的良好基質。

近年來，MOFs生物傳感平臺開發了不同的醫學和臨床應用，例如:a)癌癥或糖尿病等疾病的快速診斷和治療；b)病原體檢測；c)藥物及其代謝物的測量；d)發現新藥，e)評估和測量生物樣品中的分析物，并使用快速測試早期檢測疾病。此外，對MOFs的光吸收和發射特性的調控可以促進對細胞和生物分子的特異性分子識別。

最常報道的病毒檢測方法是基于病毒核酸序列的鑒定。多核苷酸作為開發生物雜交系統的平臺，該系統含有一條發射染料標記的核酸鏈，該核酸鏈具有與靶病毒核酸互補的序列。圖1描述了病毒核酸檢測中使用的基于多核苷酸熒光的方法所涉及的一般機制。

圖1. 基于MOFs促進的探針發射恢復的不同目標檢測過程的示意圖。

2.1 埃博拉病毒

埃博拉病毒（EV）屬包括六個已知物種，以它們首次被發現的地區命名:扎伊爾埃博拉病毒(ZEV)、蘇丹埃博拉病毒(SEV)、塔林埃博拉病毒(TFEV)、本迪布焦埃博拉病毒(BBEV)、萊斯頓埃博拉病毒(REV)和邦巴利埃博拉病毒(BEV)。這些毒株中有四種(SEV、BBEV、TFEV和ZEV)可以感染人類，有些在過去曾引起嚴重的出血熱暴發。最近的一個例子是ZEV，它造成了2014年西非的一次毀滅性打擊。該疾病的嚴重性、其高傳染性傳播潛力以及在有效疫苗開發方面缺乏重大進展，使得人們對早期檢測，特別是在最常見的受影響地區的早期檢測高度重視。因此，目前需要同時具有高靈敏度和快速響應的生物傳感器。

Anal. Chem.：3D Cu基兩性離子MOFs病毒選擇性熒光生物傳感器

南方醫科大學的陳金香和陳文華兩位教授制備了一種水相穩定的三維銅基金屬有機框架(MOF)。該MOF具有獨特的孔隙形狀，帶有芳香環、帶正電荷的吡啶和不飽和的Cu(II)陽離子中心、游離羧酸、鑲嵌的H₂O和配位的SO₄^2?在孔隙表面。該MOF可以通過靜電、π-stacking和/或氫鍵與兩個羧基熒光素(FAM)標記的單鏈DNA序列相互作用形成兩個P-DNA@MOF體系，從而通過光誘導電子轉移過程猝滅FAM的熒光。這些P-DNA@MOF系統可作為有效的熒光傳感器用于人類免疫缺陷病毒1雙鏈DNA和蘇丹病毒RNA序列，檢測限分別為196 pM和73 pM，這表明敏感性高，遠低于患者通常的病毒載量，在疾病進展的第二天，病毒載量可高達10⁷?RNA copies/mL。 ?

Platforms Formed from a Three-Dimensional Cu-Based Zwitterionic Metal–Organic Framework and Probe ss-DNA: Selective Fluorescent Biosensors for Human Immunodeficiency Virus 1 ds-DNA and Sudan Virus RNA Sequences. Anal. Chem. 2015, 87, 24, 12206–12214

這項研究為在基于MOFs生物傳感器檢測病毒的開發中更廣泛地使用這些策略或其改性鋪平了道路。例如，它顯然引發了這樣一個問題:由于使用更長的探針DNA序列，使用更大孔徑的MOFs如何影響病毒檢測。 ?

Chem. Comm.:?含鏑的兩性羧酸鹽的水穩定MOFs:埃博拉病毒RNA序列的傳感平臺

2016年南方醫科大學的陳金香和陳文華兩位教授報告了一種水穩定的3D鏑基金屬有機框架(MOF)，可以與探針ss-DNA非共價相互作用。該體系可作為檢測埃博拉病毒互補RNA序列的有效熒光傳感平臺，檢測限為160 pM。

A water-stable metal–organic framework of a zwitterionic carboxylate with dysprosium: a sensing platform for Ebolavirus RNA sequences. Chem. Commun., 2016,52, 132-135

這兩篇文章在本質上是非常互補的，因為它們清楚地表明，MOFs的性質對總體反應有很大的影響。然而，這兩篇文章都沒有研究重要的細節，例如，每種多金屬氧化物的晶體形態(顆粒大小和表面積)對與標記的DNA探針的相互作用以及對傳感機制的影響。此外，這兩份報告中沒有孔隙度測量值。

前人已述MOFs是多功能平臺，適用于多種分析物的檢測。這種多重作用已經被實際應用于在非常早期階段檢測EV感染。眾所周知，埃博拉病毒和其他單鏈RNA病毒家族的病毒會產生小的非編碼RNA序列，稱為微RNA (miRNA)，在非常早期的患者血液中出現。因此，miRNA和SEV RNA序列的雙重檢測可以實現疾病的準確和早期檢測，提供更簡單、更快和更便宜的診斷工具。[Talanta 180 (2018) 396–402.]?然而，必須注意的是，MOFs生物傳感平臺仍處于早期開發階段，僅作為這一概念適用性的證明。下一步實施基于MOFs的檢測，必然意味著將它們整合到一個可工作的便攜式設備中，并在選定的組件中重新評估它們的功能。

2.2 人類免疫缺陷病毒

人類免疫缺陷病毒(艾滋病毒)是獲得性人類免疫缺陷綜合征(艾滋病)的病原體。艾滋病毒是一種逆轉錄病毒，其遺傳信息由一條RNA單鏈編碼。為了復制，病毒RNA需要轉化為雙鏈DNA (dsDNA)，并通過稱為逆轉錄的過程整合到感染細胞的基因組中。宿主細胞整合的艾滋病毒DNA被稱為前病毒DNA，它可以保持潛伏或被轉錄以產生新的病毒顆粒。更重要的是，在已經接受艾滋病毒藥物治療的患者中存在前病毒脫氧核糖核酸是病毒對治療產生耐藥性的良好指標。

Analyst: MOF MIL-101作為低背景信號平臺用于無標記DNA檢測的

西南大學的李原芳教授和趙希娟副教授引入MIL-101(Cr₃F(H₂O)₂O[(O₂C)–C₆H₄—(CO₂)]₃·nH₂O)作為淬滅平臺，以降低SYBR Green I(SG)/探針DNA復合物的高背景熒光。機理研究表明，MIL-101可以通過π-π堆積和靜電相互作用強烈吸附SG/探針DNA復合物，結果SG染料的熒光被大大猝滅。而在有靶DNA存在的情況下，DNA的初生剛性雙鏈(ds)結構會遠離MIL-101的表面；同時，SG染料可以以嵌入和小凹槽結合的方式與dsDNA結合，導致SG染料熒光增強。

Metal-organic framework MIL-101 as a low background signal platform for label-free DNA detection. Analyst, 2014, 139, 801-806

利用吸附SYBR Green I的ssDNA探針，將其與MIL-101(Cr)結合，可有效檢測ssHIV-1病毒DNA。目標單鏈與探針快速雜交形成dsDNA。在0.1-14 nM范圍內，增加的信號背景比與目標DNA濃度呈線性關系，LOD為73 pM。值得注意的是，單堿基錯配的靶DNA是可以用非常有效的方法鑒別的。作者使用MIL-101(Cr)將信號背景比提高了近8倍，表明MOF確實是一個有效的低背景信號噪聲平臺，遠低于基于碳納米管和氧化石墨烯平臺的檢測限。

2.3 日本腦炎

日本腦炎病毒(JEV)是一種單鏈核糖核酸病毒，可導致潛在的致命感染，死亡率為25-30%。最近剛剛報道了使用表面改性的多磺酸粘多糖對其進行檢測。這一過程極具創新性，不僅因為使用了表面修飾工具，更重要的是，它可以檢測整個病毒顆粒，而不僅僅是病毒的遺傳物質。所用的MOF是MIL-101(Cr)，它首先涂上一層二氧化硅，然后用一種叫做分子印跡的技術用丙烯酸鋅處理。（圖）在此過程中，丙烯酸酯聚合物在多孔質膜表面的沉積是在作為聚合模板的JEV全病毒顆粒存在下進行的。去除模板顆粒后，加入聚乙二醇作為封閉劑，封閉表面孔隙。這一步旨在增強傳感器的能力，特別是識別JEV的能力。在JEV存在下，分子聚合物的熒光強度增加。這種增加在統計學上是顯著的，表明可以以高靈敏度檢測目標。JEV濃度范圍為50至1400 pM時，熒光增強響應呈線性，最低檢出限僅為13 pM。JEV平臺的特異性受到其他病毒的挑戰，即甲型肝炎病毒(HAV)、麻風病病毒和狂犬病病毒，它們的熒光強度較低。（如下圖，基于MIL-101的病毒分子印跡聚合物的制備原理及日本腦炎病毒(JEV)的檢測）

2.4 甲型肝炎

MIL-101 MOF被進一步證明是探測HAV全粒子的良好平臺。在這份2020年1月的最新報告中，MIL-101涂有一層對pH值敏感的聚合物——甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，該聚合物同樣是通過分子印跡技術制備的。這種聚合物有HAV形狀的空腔，專門用于目標HAV粒子。檢測采用了簡單的共振光散射技術。當HVA粒子被吸附到納米粒子的分子印跡表面時，它們導致粒子尺寸增加，隨后激光共振光散射強度增加。隨著目標HVA濃度的增加，更多的病毒顆粒被吸附，導致與共振光散射強度的相關性。在470 nm的工作波長下，觀察到濃度在0.02至2.0 nM之間的線性劑量-反應相關性。平臺的LOD極低，為0.1 pM，響應時間為20分鐘。[Microchim. Acta.2020,?187,140]（如下圖，用于檢測甲型肝炎病毒的分子印跡納米探針的制備示意圖(HVA)）

3. 總結

MOFs獨特的性能組合，在開發生物傳感器時帶來了強大的優勢，即大尺寸的孔、擴大的表面積和易于調節。值得注意的是，大多數報道的病毒檢測研究都使用帶電荷的配體來提供帶有正電荷表面的材料，這些材料與帶負電荷的DNA探針相互作用。共軛探針@MOF平臺表現出優異的性能，對目標分析物具有高特異性，檢測限非常低，通常在納摩爾范圍內。根據所研究的平臺，響應時間顯示從2-3分鐘到超過一刻鐘不等，因此是保證優化以允許更快響應的參數之一。各種MOFs化合物的微晶尺寸與檢測能力有一定的相關性。當與標記的探針相互作用時，MOFs顆粒似乎可以提供優勢。然而，在文獻中關于MOFs顆粒大小對檢測病毒核酸鏈的功效的作用的信息仍然不足。同樣，在大多數情況下，關于這些相互作用中材料孔隙率的作用的信息很少或沒有。孔隙度甚至可能是一個阻礙因素，因為一些例子表明，當孔隙不足以使DNA鏈遷移時，熒光恢復和恢復時間往往更長。維度和檢測能力之間的關系最為相關，實例表明分層結構，尤其是非常薄的分層結構，是與探針相互作用和將檢測極限推向較低值的最佳選擇。

MOFs開始被用作治療病毒感染的活性成分的輸送系統。再一次，這些材料在治療方面的優勢與它們的多孔結構有關，能夠攜帶大量的活性成分，并且能夠微調顆粒大小和形狀以適應與不同遞送途徑的生物力學和物理化學參數相關的需要。

在這一研究領域仍有許多工作要做，在基于MOFs傳感器或任何其他為原位應用開發的傳感器能夠有效地投入實際應用之前，從血液樣本中提取RNA仍然是需要克服的最明顯的關鍵步驟。隨著最近的2020年新冠肺炎大流行，世界肯定不會和原來一樣了。希望這場健康危機將刺激研究人員和利益相關者加快研究的步伐。新的解決方案和技術將為更光明的未來而出現。

推薦文獻：

[1] J.Y. Yang et al., A novel fluorescence molecularly imprinted sensor for Japanese encephalitis virus detection based on metal organic frameworks and passivation-enhanced selectivity. Talanta 212 (2020) 120744.

[2] L.H. Luo et al., Molecular imprinting resonance light scattering nanoprobes based on pH-responsive metal-organic framework for determination of hepatitis A virus. Microchim. Acta 187 (2020) 140

[3] H. Huang et al., COVID-19: A Call for Physical Scientists and Engineers. ACS Nano 14 (2020) 3747–3754.

[4] J. Yang, Y.-W. Yang, Metal–Organic Frameworks for Biomedical Applications. Small 16 (2020) 1906846.

[5] L. Jiao et al., Metal–organic frameworks: Structures and functional applications. Mater. Today 27 (2019) 43–68.

[6] ] Q. Qiu et al., Recent advances in the rational synthesis and sensing applications of metal-organic framework biocomposites. Coord. Chem. Rev. 387 (2019) 60–78.

[7]?D.I. Osman et al., Nucleic acids biosensors based on metal-organic framework (MOF): Paving the way to clinical laboratory diagnosis. Biosens. Bioelectron. 141 (2019) 111451.

本文由納米小白供稿。

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