“看見”化學反應——原子級分辨率透射電子顯微鏡是哪路神仙？

引言

分子是一種量子力學范疇內的實體，因此“親眼見證分子的運動和反應”就成了化學家們孜孜以求的目標和夢想。而現在有了原子級分辨率透射電子顯微鏡，這個夢想終于實現。原子級分辨率透射電子顯微鏡又叫單分子原子分辨率實時TEM成像（SMART-TEM），早在2007年日本東京大學的Eiichi Nakamura就利用這一技術報道了單個碳氫化合物分子的構象變化，從此SMART-TEM開始進入了快車道發展階段。

制造“漁具”捕捉分子

為了實現“看見”分子運動或者反應的目標，我們首先要在溶液中捕捉到目標分子，并將其帶到納米尺度的TEM視野中。針對這一問題，研究人員創造了各種“漁具”，用以在溶液中“釣”到感興趣的“漁獲”（分子）。其中，碳納米管（CNT）及其錐形變體碳納米角（CNH）憑借剛性和TEM接近的透明度而成為“釣魚竿”的最佳選擇。

圖1?纏繞碳氫化合物鏈的連續時間TEM圖像^[1]

• 范德華“鰻籠”

在最初的研究中，Eiichi Nakamura等人受到碳納米管裝載富勒烯的啟發，提出了將碳納米管作為“鰻籠”用以困住碳氫分子的策略^[1]。由此，研究人員可在TEM中獲得連續時間內的纏繞型碳氫分子的運動行為（圖1）。然而，這一方法只適用于具有疏溶劑性質的小分子，同時該小分子還要對碳納米管展現出親和性。

• 共價“魚鉤”

與碳納米管憑借范德華力進行“捕獲”不同，具有氨基的CNH可以作為化學“魚鉤”進行分子捕捉。利用標準的酰胺成鍵反應，研究人員可將分子固定到CNH上，從而在TEM中進行成像。

• 非共價“魚鉤”

最后，有研究還提出了一種“離子吊鉤”，即CNH 羧酸鹽陰離子在甲醇中可困住三價釓等金屬陽離子，并將這些金屬離子帶到TEM銅網上進行成像。與此類似，通過陰/陽離子的結合可以設計多種多樣的“魚鉤”，甚至可將此種策略拓展到氫鍵等弱相互作用力范圍，形成超分子“吊鉤”。

SMART-TEM的獨特之處

經典的結構分析可以在氣、液、固相以及平整的基質表面實現。而在SMART-TEM成像中，成像分子被連接到振動緩慢的碳納米管上，因此可將分子/碳納米管系統視為耦合的振蕩器。在該系統中，碳納米管熱振動的低頻部分通過碳氫單鍵或者范德瓦爾斯接觸傳遞到成像分子上。盡管如此，在實際觀測中研究人員發現，各向異性分子/原子運動在很大的溫度范圍（4-793K）內幾乎不會受到碳納米管溫度的影響。

研究范例

1. [60]富勒烯的二聚化^[2]

高分辨TEM已經證明了其是一種可對小分子及其運動進行時間分辨成像的強大工具。而下一個挑戰就是如何通過監控反應分子原子級區位的時間相關變化來對化學反應進行可視化。一旦這一策略和目標得到實現，就能夠獲得其他方法所無法獲得的重要信息。

富勒烯分子逐漸鍵合的高分辨圖像

針對這一挑戰，日本產業技術綜合研究所（AIST）的Masanori Koshino等人成功探索了一個化學反應可視化的案例，即在碳納米管內觀察到了富勒烯的二聚化過程。在碳納米管這一有限的納米尺度環境中，反應分子只能在一個維度進行平移運動，其自由度會顯著減少。因此，研究人員得以在碳納米管中觀察分析富勒烯和金屬富勒烯的雙分子反應。研究顯示，富勒烯二聚化在初步階段是可逆的，這是因為在兩個富勒烯分子間產生了非鍵合的自由旋轉；而在第二階段，電鏡視野中出現了融合結構的襯度，這說明兩個富勒烯分子進一步融合形成花生型結構；進一步的電子束輻照會促進形成具有缺陷的管狀結構，而最終產物會呈現出拉伸型花生結構。不僅如此，研究還發現高劑量的低能電子能夠提升初步階段而非第二階段，這表明第二階段所需的是高能電子。

?2. 過渡金屬簇與碳納米管的反應^[3]

高分辨TEM成像鋨簇與碳納米管之間相互作用的不同階段

鎢等過渡元素被裝載進單臂碳納米管后能呈現出截然不同的親和性和反應活性，這一現象在較早的研究中被德國烏爾姆大學的Ute Kaiser以及英國諾丁漢大學的Andrei N. Khlobystov、Elena Bichoutskaia等人成功揭示。利用低壓像差校正高分辨TEM，并在80keV電子束的激發下，研究人員發現鎢與碳納米管的反應非常弱，而錸則能在邊臂上創造局部缺陷。相比之下，鋨則能輕易地形成擴大化的缺陷，從而壓縮碳納米管的邊壁造成管狀結構的決裂。這一高分辨TEM還能在原子水平對由金屬-碳鍵合造成的結構轉變進行成像，可揭示這類鍵在調控過渡金屬簇和碳納米管之間相互作用中所扮演的角色。對反應活性進行排序可知，鋨大于錸、錸大于鎢，并且反應活性與金屬簇的尺寸、形狀或者取向均沒有關系，卻只與金屬-納米管鍵合能以及金屬-碳納米管之間轉移的電子密度數相關。因此，通過選擇合適的電子束能量，金屬-納米管相互作用可以被控制（激活或者抑制），其中當電子能量低至20 keV時，研究人員就無法觀察到碳納米管內鄰近金屬簇附近的轉變行為。

3. 成像單分子的異質成核^[4]

在分子尺度對異質成核進行觀察研究對人們來說一直以來都是巨大的挑戰。由于在分子尺度探索反應活動的難度，人們還無法對有機分子晶體在表面的成核行為進行理解和解釋。

結晶前驅體及其在CNH上結晶的SMART-TEM圖像

有鑒于此，日本東京大學的Eiichi Nakamura團隊展示了CNH表面的單分子模板可以通過介導無序移動分子納米簇的形成來實現兩個有機分子的成核結晶。為了實現這一目的，關鍵在于襯底的選擇。研究人員選擇含有氨基的海膽狀CNH聚集顆粒作為襯底，其豐富的氨基可以輕易實現酰胺成鍵。在SMART-TEM的幫助下，研究人員發現分子納米簇最多由15個分子組成，并且在在溶液中的數量也比晶體要少。同時，如果缺少單分子模板的物理吸附，晶體也不會出現。這一研究發現表明模板誘導異質成核機理由兩步均質成核步驟組成。

4. 分子鏈的構象分析^[5]

在復雜成分的分子集合體中，構象狀態的變化取決于它們之間的反應能壘。因此，有機化學家在進行實驗時，總會在分子模型中進行構象分析，以考量局部構象和全局形狀對分子的影響。然而，長期以來還沒有任何實驗方法能夠直接支持這一構象分析，從而為我們提供單分子中化學鍵的構象選擇。

在SMART-TEM中觀察到扭曲構象的分子

東京大學的Koji Harano、Eiichi Nakamura和日本產業技術綜合研究所（AIST）的Masanori Koshino等人描述了一項關于測定單個全氟烴基富勒烯中每個碳碳單鍵的構象。這些全氟烴基富勒烯分子要么被裝載進單壁碳納米管中，要么被吸附在CNH的外表面進行研究。在分析了碳納米管中82個單分子（在120 kV電子束下）后，研究發現大約6%的CF₂–CF₂鍵和大約20%的CH₂–CH₂鍵為扭曲構象，這一定量分析與基于集合體的構象數據是一致的。而TEM圖像也表明分子更傾向于以單一取向進入碳納米管。而相比于在碳納米管中，附著在CNH上的分子移動更加自由，同時展現出了更加豐富的構象，這也表明TEM是一種測定柔性分子動態形狀的多樣化策略。

?5. 復雜分子的結構變化^[6]

對于結構較為簡單分子的TEM成像可以簡便分析其構象變化，同樣地，SMART-TEM對于復雜分子的結構分析同樣非常有用。同時，碳納米管的限域效應不僅限制了裝載分子的尺寸，也限制了分子進行構象變化的可能，這些問題對于復雜分子來說顯得尤為突出。

一系列三酰胺-NH共軛物彎曲構象的TEM圖像

東京大學的Eiichi Nakamura等人利用氨基化的碳納米管取代傳統碳納米管，通過酰胺鍵鍵連生物素化的二酰胺分子，并對其進行高分辨的TEM成像測定。實驗獲得的靜態圖像和動態影像不僅能夠幫助研究人員研究分子構象，也可以呈現其隨時間變化的動態過程。進一步通過建模和模擬，研究人員還能夠從10的8次方可能性中分辨合理的構象。除此之外，這些圖像也為“碳納米管的彎曲區域具有化學活性”這一現象提供了直接的證據。

6. 觀察分子構象變化的選擇性激發行為^[7]

盡管σ鍵旋轉及隨后的構象變化是化學的基本研究領域，但對這一現象進行原子級成像長期以來都是科學家無法實現的目標。雖然，SMART-TEM的出現可以原位測定單個有機分子的構象變化，但在缺乏改變和定量分子運動量級和頻率的情況下，TEM成像還無法成為有效的研究工具。

生物素化分子及其在不同加速電壓下運動的示意圖

有鑒于此，東京大學的Eiichi Nakamura和Koji Harano等人發表文章報道了分子運動的頻率可以通過調整電子加速電壓來進行調控。在SMART-TEM中，通過降低電子加速電壓（從120到80再到60 kV）可以增大散射截面，從而提高分子運動頻率，再對TEM影像中的相鄰幀之間進行交叉關聯（cross-correlation）分析可以進一步定量這些分子運動。研究以附著在CNH上的生物素衍生物為例，發現相對較硬的分子在加速電壓為80和120 kV時顯得更為靜態，而在60 kV時振動比較頻繁；而柔性程度更高的分子在80 kV時就可以進行可觀的運動，從而通過真空中σ鍵的序列性旋轉來可視化地展現逐步能量馳豫過程。而在SMART-TEM技術發展之前，這類能量馳豫信息只能通過理論模擬的方法獲得；因此高分辨TEM的發展為實驗獲得分子信息提供了強大的工具。

展望

SMART-TEM技術發展至今，在單分子成像方面展現獨特的優勢。在這項技術中，加速的電子速度可以變得非常快，使得經過分子的時候都可以帶著埃秒級的分子信息，即使如此，電子核鍵旋轉的概率行為也使得TEM圖像解釋成為了一個相對復雜的問題。

在未來，利用TEM進行化學轉變的動力學研究是進入分子科學的量子力學世界的通道。而進一步的擴展應用還包括單個蛋白質及其運動的成像。此外，處理分子混合物成像也是這一TEM技術的獨特優勢，有望在不對原始材料進行提純凈化的條件下實現成分的結構分析。總而言之，分子及其集合體的原子分辨率級成像是一種研究納米尺度實體的簡單且強大的工具，能夠為研究人員連接量子力學和現實世界。

參考文獻

[1] Imaging of Single Organic Molecules in Motion. Science,?2007, 316, 853.

[2] Electron Microscopic Imaging of a Single Group 8 Metal?Atom Catalyzing C?C Bond Reorganization of Fullerenes. Nat. Chem., 2010, 2, 117.

[3] Interactions and Reactions of Transition Metal Clusters with the Interior of Single-Walled Carbon Nanotubes Imaged at the Atomic Scale. JACS, 2012, 134, 6, 3073.

[4] Heterogeneous nucleation of organic crystals mediated by single-molecule templates. Nat. Mater., 2012, 11, 877.

[5] Conformational Analysis of Single Perfluoroalkyl Chains by Single-Molecule Real-Time Transmission Electron Microscopic Imaging. JACS, 2014, 136, 1, 466.

[6] Imaging of Conformational Changes of Biotinylated Triamide Molecules Covalently Bonded to a Carbon Nanotube Surface. JACS, 2008, 130, 25, 7808.

[7] Electron Microscopic Observation of Selective Excitation of Conformational Change of a Single Organic Molecule. JACS, 2015, 137, 10, 3474.

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