廈門大學醫學院心血管病研究所ACS Nano:生物酶馬達驅動的工程化中性粒細胞“微型機器人”提高溶栓療法療效與安全性

【背景介紹】

當前，溶栓藥物半衰期短、出血風險高，停藥后血栓易于再次形成。幸運的是，智能性藥物輸送提供了極具潛力的解決策略，可以提高溶栓療法的療效和安全性。根據疾病特征選擇天然細胞作為相關藥物載體，具有納米尺度無法比擬的高生物相容性與特異性。多種活細胞已被開發成藥物載體，包括干細胞、單核細胞、個巨噬細胞、T細胞、中性粒細胞、血小板和癌細胞等。其中，中性粒細胞（NEs）可受炎癥刺激產生細胞形變，響應性的釋放出內含物，在活細胞遞藥系統中展示了優秀的藥物智能控釋能力。然而大量存在的內源性中性粒細胞干擾可導致遞藥效率被顯著降低，因此，對中性粒細胞進行適當的工程化改造以增進其智能遞藥效率極其必要。

【成果簡介】

基于以上研究背景，廈門大學附屬心血管病醫院/廈門大學醫學院心血管病研究所桑芒芒、鄭錦榮等人在ACS Nano上發表文章，提出利用尿素酶作為生物微馬達工程化修飾中性粒細胞以提高其機動性能的設想，工程化改造的中性粒細胞微型“機器人”攜帶納米溶栓藥物可促進血栓溶解、減少出血副作用并抑制血栓再形成。通過多聚賴氨酸包被板吸附并掩蓋一半細胞膜，在親和素/鏈霉親和素特異性結合的作用下，將尿素酶不對稱地固定在天然NEs的表面，活細胞狀態裝載經尿激酶包被的Ag納米（Ag-UK），從而制備UM-NEs（Ag-UK）系統。尿素酶催化內源性尿素生成氨氣和二氧化碳，產生推力，推動NEs前進。血管損傷后，在損傷部位形成血栓，伴隨炎癥反應和隨后的白細胞募集，而靜脈注射的UM-NEs（Ag-UK）在趨化因子作用下，經由尿素酶馬達驅動，向血栓部位前進。UM-NEs（Ag-UK）在血栓部位被激活產生中性粒細胞胞外誘捕網，從而導致Ag-UK的釋放，Ag-UK誘導溶栓以恢復血管再通。體內外評價結果證實，該UM-NEs（Ag-UK）系統具有較高的生物相容性和較長的循環時間，可顯著提高溶栓藥物的生物利用度，可用于治療持續性血栓形成相關疾病。

【圖文導讀】

圖1. NEs和UM-NEs的制備和表征。（A）Wright Giemsa染色觀察NEs形態；（B）透射電鏡觀察NEs的形態；（C）流式細胞術分析NEs純度；（D）DAPI和????????????????? 綠色核酸染料標記NEs；（E）Lyso tracker Red和DAPI染料標記NEs；（F）UM-NEs的合成路線。（G）UM-Cy5修飾后細胞成像；（H）流式細胞術檢測UM-Cy5；（I） 細胞蛋白質組的銀染分析；（J）觀察氣泡推進UM-NEs。（K）CO₂和NH₃生成。

圖2. UM-NEs（Ag-UK）體系的制備和表征。（A）Ag-UK納米顆粒的合成方法；（B）b1：羧酸銀納米顆粒的TEM圖；b2:Ag-UK納米顆粒的TEM圖像；b3:Ag-UK納米顆粒的SEM圖像；（C）Ag-UK納米顆粒的動態光散射數據和zeta數據；（D） Ag-UK納米顆粒穩定性及酶活性；（E）不同組別酶活對比；（F-G）Ag-UK-Cy5的UM-NEs攝取；（H）流式細胞術檢測UM-NEs（Ag-UK-Cy5.5）；（I）用透射電鏡觀察了UM-NEs（Ag-UK）體系的形貌；（J）不同組的蛋白質濃度。

圖3. UM-NEs（Ag-UK）的功能測試。（A）UM-NEs（Ag-UK）藥物釋放示意圖；（B，C）UM-NEs（Ag-UK）中性粒細胞形變能力評估；（D）ROS生成；（E）TEM觀察UM-NEs（Ag-UK）細胞形變與釋藥；（F）Ag-UK釋放效率；（G）使用Transwell系統評估UM-NEs（Ag-UK）的炎癥靶向能力示意圖；（H）不同組別的細胞遷移計數；（J-K）UM-NEs（Ag-UK）體外溶栓效果；（L）48小時內的藥代動力學研究。

圖4. 動脈血栓模型構建。（A-B） 頸動脈血栓模型構建示意圖；（C）觀察小鼠頸動脈血栓形成過程。（D-E）超聲分析頸動脈血流灌注情況；（F）下肢動脈血栓模型構建示意圖；（G）觀察小鼠下肢動脈血栓形成過程；（H）激光散斑血流監測系統（LSBFMS）分析下肢動脈血流；（I-J）血栓模型和對照組血管的H-E和Masson染色圖。

圖5. UM-NEs（Ag-UK）體內血栓靶向性評估。（A-C）血栓形成后血管中炎癥因子水平的變化；（D-F）血栓形成后血液中炎癥因子水平的變化；（G-H）頸動脈血栓靶向性；（I）頸動脈血栓部位的UM-NEs（Ag-UK）分布；（J-K）下肢動脈血栓靶向評估。

圖6. UM-NEs（Ag-UK）體內溶栓效果研究。（A-B）使用多普勒超聲評估溶栓治療的血流情況；（C）頸動脈血栓部位H-E染色分析；（D-H）激光散斑血流監測系統分析小鼠溶栓治療的血液灌注情況。

【小結】

綜上所述，此項研究報道了一種尿素酶馬達驅動的中性粒細胞給藥系統UM-NEs（Ag-UK），用于攜帶溶栓藥物主動靶向血栓部位，通過細胞形變釋放藥物，從而有效治療血栓。研究表明NEs具有天然的血栓靶向性，可被用作藥物載體，NEs通過炎癥趨化作用靶向血栓，在血栓部位發生細胞形變從而釋放出細胞內含物。尿素酶可作為生物馬達對NEs進行工程化改造，尿素酶催化內源性尿素生成氨和二氧化碳，產生推力，推動NEs快速靶向血栓。實驗結果表明，UM-NEs（Ag-UK）系統能快速靶向血栓部位，提供快速溶栓效果，在體內顯示出長循環能力，可用于治療持續性血管壁損傷引起的血栓性疾病。該給藥系統具有良好的生物相容性，能顯著提高溶栓藥物的生物利用度，有望用于臨床血栓性疾病的治療。

文章信息：

第一作者：鄭錦榮

通訊作者：桑芒芒

Jinrong Zheng，et al. Enzyme Catalysis Biomotor Engineering of Neutrophils for Nanodrug Delivery and Cell-Based Thrombolytic Therapy[J]. ACS Nano. 2022. doi: 10.1021/acsnano.1c08538.?

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c08538