哥大Nature Nanotech：可用于COVID-19快速檢測的新型多重逆轉錄酶定量PCR技術

Eric_zhou 1年前 (2022-08-05) 1239瀏覽

【導讀】

床旁檢測（POC）也稱現場檢測，或近患者檢測，它是一種可在短時間內將患者提供的樣本進行檢測的新興技術，因其具有無需樣品處理，檢測時間短，樣本需求量少，可在患者近旁進行實時監測的優點，而被廣泛關注。經過數十年的發展，床旁檢測技術已應用于手術室，重癥監護室或急癥室等場景，對患者的生化指標進行檢測。

隨著材料和技術的不斷發展，研究人員希望能將床旁檢測技術應用到聚合酶鏈式反應（PCR）技術中，以實現便攜地，快速地核酸檢測，特別是近兩年COVID-19在世界范圍內的流行，更需要一種快速的檢測手段。然而，傳統的PCR測試環境要求高，測試設備龐大，特別是熱循環儀等，需要充足的時間進行升溫和降溫，因此，急需開發一種現場檢測核酸并快速得到結果的技術。

【成果掠影】

近日，來自哥倫比亞大學的Samuel K. Sia教授和其團隊成員在自然·納米技術（Nature Nanotechnology）期刊上以“Multiplexed reverse-transcriptase quantitative polymerase chain reaction using plasmonic nanoparticles for point-of-care COVID-19 diagnosis”為題報道了一種可從人類唾液或鼻腔樣本中快速檢測SARS-CoV-2的RNA的小型光學器件。基于熒光探針的測試方法和等離子體納米顆粒的增強作用，該器件可在單個反應容器中實現逆轉錄酶定量PCR（RT-qPCR），并具有等離子體熱循環期間多重熒光監測的能力。

【核心創新點】

  1. 該工作首創性的將用于治療的等離子體加熱技術服務于PCR的加熱環節，解決了傳統PCR技術測試時間長，儀器大的難題。
  2. 該工作采用熒光檢測識別特定核酸的方法，取消了從樣本容器中去除金納米顆粒的環節，縮短了測試時間，提高了檢測技術的生物安全性。

【數據概覽】

圖1. 多重實時等離子體RT-PCR的測試原理和設計。a）多重實時等離子體RT-PCR的示意圖，金納米顆粒懸浮在0.2ml PCR管中的溶液中，其快速吸收LED的光并將其轉化為熱量，從而實現快速PCR熱循環；b）儀器示意圖；c）熒光檢測系統示意圖；d）系統內各組分非重疊光學光譜。@2022 Springer Nature Limited

圖2. 快速、多重、等離子體RT-PCR測試結果。a）控制良好的溫度序列，在15分鐘內顯示完整的RT-PCR；b）對a所示的數據進一步分析，整個45個周期內實現一致的加熱和冷卻速率，平均加熱速率為6.7±0.2°C/s，平均冷卻速率為 –4.7 ± 0.1 °C/s；c）等離子體RT-PCR系統的終點熒光測量的初始陽性擴增結果；d）使用純化的RNA和快速擴增的初始光熱擴增LoD數據（<16分鐘）。@2022 Springer Nature Limited

圖3. 集成實時熒光檢測，無需去除AuNR。a）在RT-PCR反應中添加AuNR（OD為18）可淬滅原始熒光信號對比圖；b）加入AuNR前后的Ct值對比；c）使用單個激發激光器和光譜儀實現多光譜檢測，多元線性回歸實現光譜反卷積；d）實時放大和檢測；e）反卷積熒光值（針對三個單獨的靶標/顏色）與周期數的對比，以計算Ct值；f）AuNR OD對加熱速率的影響；g）AuNR OD對熒光監測的影響。@2022 Springer Nature Limited

圖4. 使用多重等離子體RT-qPCR檢測SARS-CoV-2的滅活病毒和臨床標本。a）終點熒光光譜檢測；b）等離子體RT-qPCR運行的實時擴增曲線；c）N1和RP的Ct值；d）N1，N2和RP靶標的額外濃度的Ct值；e）N1 Ct值與QuantStudio（QS）比較；f）臨床唾液標本檢測十個陽性和九個陰性標本，顯示100%敏感性和100%特異性；g）接收器工作特性（ROC）曲線；h）儀器與QuantStudio的N1 Ct值的比較；i）對靶標N1的20個陽性和29個陰性樣本進行臨床鼻腔標本檢測，顯示100%的敏感性和100%的特異性；j）在i中測試的試樣的ROC曲線；k）用等離子體測試的鼻腔臨床標本與QuantStudio測試的N1 Ct值的比較；l）臨床鼻腔標本檢測20例陽性和29例陰性樣本的靶N基因，敏感性為100%，特異性為100%；m）在l中測試的試樣的ROC曲線；n）用等離子體與QuantStudio測試的鼻腔臨床標本的N基因Ct值的比較；o）繪制臨床標本連續稀釋的N1 Ct值的標準曲線；p）在等離子體儀器上測試B.1.1.7變體的連續稀釋樣本；q）對于針對中東呼吸綜合征（n = 23）和人類冠狀病毒NL63（n = 27）進行測試。@2022 Springer Nature Limited

圖5. 樣本的測試流程。a）自定義樣品盒的圖像，其中包括濾芯的拆卸組件、反應模塊、柱塞和護罩；b）使用定制樣品盒測量10μl樣品的預分析工作流程；c）用于無萃取樣品制備和等離子體熱循環的樣品到結果過程，具有實時多光譜熒光監測；d）11 種不同濾芯的測量精度實現了 9.2 ± 1.4 μl 的平均點膠量。@2022 Springer Nature Limited

【成果展示】

該工作開發了一種等離子體RT-qPCR技術，在診斷COVID-19和其他傳染病方面具有眾多優點：1）該技術無需去除樣本容器內的金納米顆粒，確保了其用于床旁檢測的生物安全性，2）該檢測技術具有較強的特異性反應，可以在早期檢測出低Ct（判斷閾值）的強陽性樣本，3）該技術還可用于多靶標病毒的靶向檢測，其在SARS-CoV-2變種越來越多的條件下，具有重要意義。總而言之，該工作所做的努力極大的促進了床旁檢測PCR技術的發展，并為當下COVID-19的快速檢測帶來了新的解決方案。

文獻鏈接：

DOI：10.1038/s41565-022-01175-4

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