學術干貨 | 熒光，你所知道與所不知道的（附帶熒光測試必備小知識）

引子

談及熒光，小編的腦海中首先浮現出一位男神——錢永健先生。因為其在綠色熒光蛋白方面的突破性研究，錢永健先生與其他兩位科學家共同分享了2008年的諾貝爾化學獎。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是一種在當今生命科學和醫學研究中被廣泛使用的示蹤物。它的出現徹底改變了科研人員的實驗策略，基于GFP的光學成像技術使人們可以直接觀察到從微觀到宏觀各個層次上豐富多彩的生命現象。

從綠色熒光蛋白的廣泛應用，我們很容易感受到熒光的魔力，下面小編就和大家聊一聊熒光這種神奇的現象。

一張圖回顧熒光基本原理

熒光的基本原理較為簡單，相信大家在本科階段的課程里已經有所接觸。以下通過一張簡單的圖片帶大家回顧一下熒光的基礎知識（學霸們跳過就好……）。

熒光的基本應用

生物探針

上圖顯示的是通過熒光能量共振轉移（FRET）現象，標記生物基因的表達過程。圖中的目標基因在沒有表達的時候，標記在不同RNA分支上的供體染料和受體染料因為淬滅劑的存在不會發光，而當細胞受到刺激，相應的基因開始表達時，轉錄出來的RNA會與改造后的RNA相接處，進而使得染料發光。（Santangelo PJ, Nix B, Tsourkas A, Bao G. 2004. Dual FRET molecularbeacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res32(6):e57.）

設計出合理的探針，對于研究生物體系中的化學反應過程是十分重要的事情。

發光材料

家喻戶曉的LED（發光二極管）基本原理就是電致熒光現象。發光二極管與普通二極管一樣是由一個PN結組成，也具有單向導電性。當給發光二極管加上正向電壓后，從P區注入到N區的空穴和由N區注入到P區的電子，在PN結附近數微米內分別與N區的電子和P區的空穴復合，產生自發輻射的熒光。而通常使用的日光燈的基本原理是光致發光。利用汞激發之后發射紫外線激發燈光中的熒光粉發出可將光進行照明。而五顏六色的熒光棒這是通過化學能激發熒光分子發光。可見發光的機理多種多樣，而正是如此，才讓我們的夜晚更加五彩斑斕。

醫學成像

這一塊小編不是很了解，只是覺得圖中這個組織被熒光物質染色的小老鼠是活不長了……（Weissleder R, Ntziachristos V. 2003. Shedding light onto live moleculartargets. Nature Med 9(1):123–128.）

單分子檢測

單分子熒光檢測在化學分析、納米材料分析、醫學診斷、法醫分析、生物材料研究等方面都具有獨特的應用價值，對許多學科領域的發展產生了和正在產生著深遠的影響。而去年獲得諾貝爾化學獎的超分辨熒光顯微技術在該領域有著十分重要的應用。

稀土發光材料

相比于有機分子，熒光稀土元素在熒光性質方面具有很大的優勢，如色度純高、壽命長等優點。從上圖某含稀土銪元素的樣品的熒光發射光譜中可以看出，該樣品的熒光發射峰較窄，這正是其色純度高的體現。而合理設計稀土元素的組成，還可以合成出上轉化發光材料。上轉換材料是一種紅外光激發下能發出可見光的發光材料,即將紅外光轉換成可見光的材料，這也是是所謂夜視鏡的基本原理。（Tang, S.; Babai, A.; Mudring, A. V.2008. Europium-based ionic liquids as luminescent soft materials. Angew. Chem., Int. Ed 47 (40)：7631-7634.）

熒光測試必備小知識

• 對于未知樣品，建議大家先測一下樣品的吸收譜，并從中找出感興趣的吸收峰和特性，在熒光測試（激發和發射光譜測試）時以便參考。
• 發射光譜：根據吸收譜中感興趣的峰確定激發波長，選擇合適的發射譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進行發射譜的掃描。
• 激發光譜：根據發射譜中感興趣的峰確定發射波長，選擇合適的激發譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進行激發譜的掃描。
• 濾光片的選擇：發射譜掃描過程中，通常選擇比激發波長長，比發射譜最短波長短的長波通型截止濾光片。激發譜掃描過程中，通常選擇比發射波長短，比激發譜最長波長長的長波通型截止濾光片。
• 狹縫的選擇：如果光路狹縫太大，熒光信號太強，容易超出儀器檢測范圍，損傷儀器；如果狹縫開的太小，熒光信號又太弱，檢測比較困難，所以要選擇大小合適的狹縫。
• 掃描速度的選擇：如果掃描太快，容易跳峰，忽略特征性的峰信號；掃描太慢則浪費時間。所以只要能掃描得到平滑的光譜曲線就可以了。

參考資料：

[1] Joseph R. Lakowicz,Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition.

[2] Santangelo PJ, Nix B, Tsourkas A, Bao G. 2004. Dual FRET molecularbeacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res32(6):e57.

[3] Weissleder R, Ntziachristos V. 2003. Shedding light onto live moleculartargets. Nature Med 9(1):123–128.

[4] Tang, S.; Babai, A.; Mudring, A. V.2008. Europium-based ionic liquids as luminescent soft materials. Angew. Chem., Int. Ed 47 (40)：7631-7634.

本文由材料人編輯部何鑫供稿，材料牛編輯整理。

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