Adv. Mater.：細胞轉換為高效的微反應器應用于血液解毒

【引言】

成熟的紅細胞（RBC）因缺乏細胞核和大部分細胞器，為血紅蛋白提供了最大的空間。正因為其獨特的中空結構、優異的的生物相容性和較長的血液循環時間，在生物載體方面具有獨天獨厚的優勢，且可作為微反應器用于生物體內應用。但是，紅細胞要成為一個理想的微反應器，最關鍵的是必須解決磷脂雙分子層引起的細胞膜限定的和選擇性的滲透性。

【成果簡介】

最近美國國立衛生研究院Iqbal Unnisa Ali、陳小元教授和中南大學胡碩副教授（共同通訊作者）等人重整紅細胞成為有效的微反應器并應用于生物醫學方面。作者在低滲培養液中將解毒酶負載在紅細胞上，封裝之后用Triton X-100 (TX)膜穿孔試劑處理，進一步增強細胞膜的通透性，緊接著用戊二醛固定細胞，得到重整之后的紅細胞（Ref-RBCs）。重整后的紅細胞具有很高的通透性、容易保存且保留了原始紅細胞的形狀和長循環時間等優點。作者用尿酸和氰化鉀作為體內和體外毒素模型研究重整紅細胞這個微反應器的解毒效率，實驗證明具有很高的解毒效率和毒素清除速率，且成功應用于小鼠活體研究中。該成果以“Converting Red Blood Cells to Efficient Microreactors for Blood Detoxification”為題于2016年11月28日發表在期刊Advanced Materials上。

【圖文解讀】

示意圖1 天然的紅細胞轉換為生物反應器及它們在血液解毒中的應用

(a)負載解毒酶的天然紅細胞通過Triton X-100和戊二醛處理轉換為高滲透的微反應器。

(b)血液中的內毒素或外毒素進入重整的紅細胞在負載的解毒酶作用下轉化為非毒性或低
毒性的分子。

圖1 蛋白負載和酶活性檢測

(a)在低滲溶液中負載酶至紅細胞中，再在等滲溶液中密封膜的示意圖。

(b)PBS溶液濃度對紅細胞攝入BSA-FITC的影響圖。

(c)原始紅細胞的明場顯微鏡成像圖。

(d)紅細胞負載BSA-FITC后的明場顯微鏡成像圖。

(e)紅細胞負載BSA-FITC后的共聚焦熒光顯微鏡成像圖。

(f)紅細胞負載BSA-FITC后的截面的共聚焦熒光顯微鏡成像圖（成像圖的頂部和底部來源于不同的截面。細胞膜由紅色染料Dil染色；左邊：FITC通道；中間：Dil通道；右邊：合并圖）。

(g)負載BSA-FITC的紅細胞的流式細胞分析圖（1.PBS溶液沖洗7次；2.Tween-20-PBS溶
液沖洗3次；0.2 × PBS溶液預處理，再孵育BSA-FITC）。

(h)HRP 催化ABTS-H2O2反應的插圖。

(i)加入負載HRP的紅細胞及裂解物后的ABTS-H2O2反應的紫外可見光譜圖。

(j)負載HRP的紅細胞及裂解物的相對催化活性圖。

圖2 通透化和穩定化的紅細胞生物反應器

(a)TX的化學結構圖。

(b)TX的濃度動力學圖（在臨界膠束濃度以下，TX分子為單體；當濃度達到甚至大于臨界膠束濃度時，TX分子聚集形成膠團）。

(c)氣孔允許底物或產物進出自由擴散同時截留酶和蛋白。

(d)Hb的結構和不同濃度的TX處理后負載Hb的紅細胞上清液的紫外可見光譜圖。

(e)BSA的結構和不同濃度的TX處理后負載BSA-FITC的紅細胞上清液的紫外可見光譜圖。

(f)TB的化學結構和不同濃度的TX預處理后的紅細胞裂解液孵育TB后的紫外可見光譜圖。

(g)RhB的化學結構和不同濃度的TX預處理后的紅細胞裂解液孵育RhB后的紫外可見光譜圖。

(h)37℃，PBS溶液中， L-RBC, L-RBC-TX, L-RBC-TX-GA 釋放BSA-FITC的48h的結果圖。

(i)4℃，PBS溶液中， L-RBC, L-RBC-TX, L-RBC-TX-GA 釋放BSA-FITC的7d的結果圖。

(j)戊二醛穩定紅細胞氣孔的插圖。

圖3 重整的紅細胞的形態表征和巨噬細胞內吞分析

(a)L-RBC-TX的共聚焦熒光顯微鏡成像圖（FITC通道）。

(b)L-RBC-TX-GA的共聚焦熒光顯微鏡成像圖（FITC通道）。

(c)RBC的大小分布柱狀圖。 ? ? ? ? ? ? ??(d)L-RBC的大小分布柱狀圖。

(e)L-RBC-TX的大小分布柱狀圖。 ? ?(f)L-RBC-TX-GA的大小分布柱狀圖。

(g)L-RBC-TX 和 L-RBC-TX-GA的FITC熒光強度的流式細胞柱狀圖。

(h)孵育不同濃度的重整紅細胞48h后的293T細胞的體外生存活力圖。

(i)未處理的Raw 264.7對照組的流式細胞分析圖。

(j)Raw 264.7和HRP-FITC-Ref-RBC共孵育4h的流式細胞分析圖。

(k)Raw 264.7和HRP-FITC-Ref-RBC共孵育12h的流式細胞分析圖。

(l)未處理的Raw 264.7及Raw 264.7和HRP-FITC-Ref-RBC共孵育4h、12h的FITC熒光強度的柱狀圖。

(m)未處理的Raw 264.7對照組的流式細胞分析圖。

(n)Raw 264.7和HRP-FITC共孵育4h的流式細胞分析圖。

(o)Raw 264.7和HRP-FITC共孵育12h的流式細胞分析圖。

(p)未處理的Raw 264.7及Raw 264.7和HRP-FITC共孵育4h、12h的FITC熒光強度的柱狀圖。

(q)Raw 264.7細胞與HRP-FITC-Ref-RBC共孵育4h后的熒光顯微鏡成像圖。

(r)Raw 264.7細胞與HRP-FITC 共孵育4h后的熒光顯微鏡成像圖。

圖4 Ref-RBC的原子力顯微鏡成像表征和力學測量

(a-c) 紅細胞的二維高度形態成像圖。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??(d) 紅細胞的三維高度形態成像圖。

(e-g) L-RBC-TX-GA的二維高度形態成像圖。 ? ? ?(h) L-RBC-TX-GA的三維高度形態成像圖。

(i) RBC 和 L-RBC-TX-GA的邊緣和中心的平均高度的柱狀圖。

(j) RBC 和 L-RBC-TX-GA的邊緣和中心的平均直徑的柱狀圖。

(k) RBC的楊氏模量和高斯擬合曲線的柱狀圖。 ? ??(l) L-RBC的楊氏模量和高斯擬合曲線的柱狀圖。

(m) L-RBC-TX的楊氏模量和高斯擬合曲線的柱狀圖。

(n)L-RBC-TX-GA的楊氏模量和高斯擬合曲線的柱狀圖。

(o) 不同細胞的楊氏模量平均值的柱狀圖。 ? ? ? ? ??(p) 不同細胞的楊氏模量最值分布的柱狀圖。

圖5 分子進入的速率和酶催化效率

(a)TB在不同時間段的細胞內濃度變化圖。

(b)攝入TB的動力學變化圖（k:擴散速率;C0:細胞外的TB濃度）。

(c)2 × PBS溶液中，不同細胞在與TB孵育不同時間段的熒光顯微成像圖。

(d)RhB在不同時間段的細胞內濃度變化圖。

(e)攝入RhB的動力學變化圖（k:擴散速率;C0:細胞外的RhB濃度）。

(f)2 × PBS溶液中，不同紅細胞在與RhB孵育不同時間段的熒光顯微成像圖。

(g)紅細胞內酶催化反應的插圖。

(h)不同紅細胞催化ABTS-H2O2 反應的可視化圖。

(i)不同紅細胞催化ABTS-H2O2 反應10min后產物的紫外可見吸收光譜圖。

(j)不同紅細胞相對活性的柱狀圖(HRP-RBC裂解物的活性設定為1)。

圖6 體外解毒實驗

(a)UA-HRP級聯反應評估尿酸降解效率的示意圖(尿酸、水和氧氣在尿酸酶的作用下生成尿囊素和過氧化氫；過氧化氫在辣根過氧化物酶的作用下氧化ABTS生成有色物質(ABTS.+)；417nm的吸光度的變化值可以用于評估尿酸的降解水平)。

(b)PBS溶液中，Ur-Re-RBC 和Ur-RBC 催化尿酸降解的可視化圖。

(c)PBS溶液中，Ur-Re-RBC 和Ur-RBC 催化尿酸降解的417nm處的紫外可見吸收變化圖。

(d)新鮮的鼠血清中，Ur-Re-RBC 和Ur-RBC 催化尿酸降解的可視化圖。

(e)新鮮的鼠血清中，Ur-Re-RBC 和Ur-RBC 催化尿酸降解的417nm處的紫外可見吸收變化圖。

(f)硫氰酸酶催化反應和鐵離子的比色反應評估氰化鉀降解效率(KCN和S2O32?在硫氰酸酶催化下生成SCN?，SCN-與鐵離子在酸性條件下形成棕色復合物；460nm的吸光度變化可以用來評估氰化鉀降解水平)。

(g)PBS溶液中，Rh-Re-RBC 和Rh-RBC 催化氰化鉀降解的可視化圖。

(h)PBS溶液中，Rh-Re-RBC 和Rh-RBC 催化氰化鉀降解的460nm處的紫外可見吸收變化圖。

(i)新鮮的鼠血清中，Rh-Re-RBC 和Rh-RBC 催化氰化鉀降解的可視化圖。

(j)新鮮的鼠血清中，Rh-Re-RBC 和Rh-RBC 催化氰化鉀降解的460nm處的紫外可見吸收變化圖。

圖7 藥代動力學性質和Ref-RBC反應器的體內血液排毒實驗

(a) Luc-Ref-RBC的血液存活圖（Luc,Luc-RBC, Luc-RBC-TX, Luc-RBC-GA作為對照組）。

(b) BSA-IR-Ref-RBC在不同器官中的體內分布柱狀圖（BSA-IR, BSA-IR-RBC,BSA-IR-RBC-TX, BSA-IR-RBC-GA作為對照組）。

(c) BSA-IR-Ref-RBC在不同器官中的體內分布熒光成像圖（BSA-IR, BSA-IR-RBC,BSA-IR-RBC-TX, BSA-IR-RBC-GA作為對照組）。

(d) 小鼠模型的體內血液解毒示意圖。

(e) 中毒老鼠在Ur-Ref-RBC作用下的體內尿酸降解圖（RBC, Ur-RBC, Ur-RBC-TX,Ur-RBC-GA作為對照組）。

(f) 血清中尿酸分析檢測的可視化圖。

【展望】

紅細胞是一種天然的藥物運載體，有望用于受限于細胞膜配體的靶向藥物運載。可封裝各種納米顆粒、顯像劑、治療藥物，為紅細胞成為新型的診療一體化平臺提供廣闊的前景。

文獻鏈接：Converting Red Blood Cells to Efficient Microreactors for Blood Detoxification (Adv. Mater., 2016, DOI: 10.1002/adma.201603673)

本文由材料人生物材料組鄧宏華供稿，材料牛編輯整理。

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