Nature子刊綜述：腫瘤納米醫療：進展、挑戰與機遇

【引言】

由于治療腫瘤傳統方法的固有缺陷，納米技術被應用于治療腫瘤以便提高效率和安全性（下文用腫瘤納米醫療表示這種技術）。在這個領域中已經取得了很大的技術成就，但是腫瘤生物學的復雜性和異質性、對納米-生物相互作用了解的不完全性、以及在臨床轉化和商業應用中對化學、制造和控制的苛刻要求成為納米醫療的主要障礙。最近哈佛醫學院的Omid C. Farokhzad（通訊作者）等人發表了一篇關于腫瘤納米醫療的綜述，這篇綜述突出了腫瘤納米醫療的進展、挑戰和機遇，還討論了幾種提高腫瘤治療效率的新穎的工程方法，這些方法是隨著對腫瘤生物學、納米-生物相互作用理解的加深而提出來的。

1、簡介

將納米技術應用于腫瘤治療受到廣泛關注（圖1），這主要歸功于其在藥物輸運、診斷、成像、發展合成疫苗和微型醫療裝置中的獨特作用，以及某些納米材料本身具有的治療效果（Box1）。具有某些特征（如促進的循環周期、降低的毒性）的納米療法已經實現了臨床轉化，其它的在臨床轉化中表現出很大的潛力，在不久的將來就會有結果。有幾種治療性的納米平臺已經被許可用于癌癥治療，如脂質體、白蛋白納米顆粒和聚合物囊泡，更多的治療模式正在進行臨床試驗，如化學療法、高溫療法、輻射治療、基因或者RNA干擾（RNAi）治療以及免疫療法（表1）。

Box 1 納米技術在腫瘤應用中的獨特特征

盡管腫瘤納米醫療取得了很大的進步，我們逐漸意識到在前面存在的挑戰與機遇。首先，腫瘤生物學的復雜性和異質性要求仔細選取病人以便確定哪些病人能夠受益于給定的療法，這類似于已經被許可或者正在發展的用于具有某種生物標記物的病人群體的靶向療法。大多數治療實體腫瘤的納米顆粒都是全身給藥的，它們通過高通透性和滯留效應（EPR）在腫瘤中富集，EPR被認為是腫瘤血管滲漏和淋巴引流差的結果 ，但是這種理解過于簡單，因為在納米顆粒的全身輸運過程中很多的生物過程會影響EPR，如納米顆粒-蛋白質相互作用、血液循環、納米顆粒滲入并且與血管周圍的腫瘤微環境（TME）作用、腫瘤穿透以及細胞內化。反過來，納米顆粒的性質（如尺寸、性質、表面特征、孔隙率、成分和靶向配體）也會影響這些生物過程，從而影響EPR和治療效果（圖2）。然而應當指出，目前對納米顆粒在活體內行為的理解大部分來源于動物實驗數據，將這些行為移植到人體內的研究還非常少。雖然已經有幾個實驗研究了納米顆粒在不同物種中的前臨床和臨床藥物動力學表現，很少有相關的數據能夠根據動物實驗結果預測其在人類身上的安全性和效率。

這篇綜述致力于探討為什么癌癥納米醫療還不能發揮其延長病人壽命的潛力，以及對目前關于腫瘤生物學和納米-生物相互作用的理解進行概括。由于EPR的重要作用，我們提供了在研究EPR和確定其生物標記物從而預測其對納米顆粒的響應、以及發展新的策略來提高EPR和治療效率方面的最新進展。我們還討論了發展靶向TME納米技術的基本原則，最后就腫瘤納米醫療臨床轉化中存在的困難提出了我們的看法。

圖1 腫瘤納米醫療發展中的關鍵時間點

（注：EPR：高通透性和滯留效應； FDA：美國食品藥品管理局；nab：白蛋白限制納米顆粒；NP：納米顆粒； PRINT：非潤濕模板復形法）

2、納米醫療平臺的種類

納米技術在過去的幾十年間對腫瘤學的發展做出了重要貢獻（圖1，表1）。脂質體是第一種被許可用于臨床中治療腫瘤的納米顆粒，與其它基于脂質體的納米顆粒一起，在臨床階段的納米療法中占有很大的比例。雖然將藥物包裹在脂質體中能夠改善藥物動力學和生物分布，但是與傳統的藥物相比，市場上的脂質體治療藥劑并不能提高總的存活率（OS）。最近在急性髓系白血病病人身上進行的第三階段試驗結果表明脂質體包裹阿糖胞苷（cytarabine）-道諾霉素（daunorubicin）（Vyxeos）能夠提高OS（從5.95個月提升到9.56個月），Vyxeos的許可申請在2016年底已經提出。納米白蛋白包裹的紫杉醇（paclitaxel，Abraxane）是第二種商業化的納米醫療，納米白蛋白能夠加載疏水性藥物而且大大減少了有毒物質的使用，使其能夠被注射更大的劑量和具有更快的給藥速率，從而提高C_max（注射后藥物或者納米顆粒在血漿中所能達到的最大濃度）和血漿AUC（血漿中藥物濃度-時間關系曲線下的面積）。靜脈注射后Abraxane快速解離為白蛋白和紫杉醇，并且對紫杉醇的藥物動力學和生物分布沒有潛在的影響。雖然在3周一次的用法中Abraxane比紫杉醇性能更優（就它們對乳癌病人的腫瘤擴散的響應速率和響應時間來說），一周一次的用法對非擴散腫瘤和OS并沒有表現出相同的趨勢，并且還增加了毒性。聚合物囊泡（如Genexol-PM和 NK105）和聚合物納米顆粒（如CRLX101 、BIND-014 和AZD-2811）是兩種更新型的納米治療藥劑，最近BIND-014、CRLX101和NK105的臨床試驗結果令人失望，突出了重新考慮發展策略，包括對病人的選取來確定那些最有可能對納米醫療響應的病人的重要性。無機納米顆粒（如金納米殼、四氧化三鐵納米顆粒、氧化鉿納米顆粒）也被用于納米治療，基于四氧化三鐵的NanoTherm已經在歐洲商業化用于治療惡性膠質瘤。

更引人注目的是，我們對納米-生物相互作用的理解和納米醫療平臺的種類都在急速增加。PubMed上關于“nanoparticle”的文章總數在2000到2014年間差不多每兩年都會翻一番，超過了1980年代關于單克隆抗體（mAb）文章的增長速度。mAb的文章轉化成了重要療法的發展，我們相信這在納米醫療也會同樣發生。

除了作為化學療法的載體外，納米顆粒輸運其它的抗癌物質也很有潛力（如分子靶向劑、反義寡核苷酸、siRNA、mRNA）。進一步，基因和化學工程技術還促進了病毒納米載體的發展，例子包括用歐洲委員會許可的肌注腺伴隨病毒治療脂蛋白脂酶缺乏、目前處于各種臨床階段的用于基因治療和和免疫療法的慢病毒、用在動物身上進行腫瘤治療的工程植物病毒（如煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒）。用外來體和新型的無機納米顆粒（如納米金剛石和石墨烯）作為載體也引起了人們的興趣。

將診斷和治療功能集成在一種納米顆粒中可以獲得治療診斷納米醫療平臺，這種平臺可以監控藥物動力學、治療藥物的積累以及疾病的發展，進一步研究腫瘤內和病人間的異質性，從而發展個性化醫療。通過同時輸運幾種活性藥劑，納米顆粒能夠促進協同治療以及避免某些抗藥機制，如表2中的樣品所示。除了輸運藥物外，納米技術也在免疫療法治療癌癥領域發力，納米顆粒作為抗原或者佐劑的載體用于發展合成疫苗受到越來越多關注，因其具有更好的組織穿透力、被淋巴系統獲取能力、更容易被表達抗體的細胞攝取、能持續釋放抗原或者佐劑以及更強的吞噬體逃逸能力。

納米技術有很大的潛力能夠克服生物制劑的缺點，包括用于免疫療法治療癌癥的mAbs。比如直接注射生物制劑會誘導抗藥抗體（ADAs）的生成，從而嚴重影響他們的安全性和效率。最近用致耐受性的納米顆粒加載納巴霉素可以防止生物制劑在小鼠和非人類靈長類動物中誘導ADAs的形成，目前這方面的人類臨床試驗正在進行。我們預計隨著對納米-生物相互作用理解的加深、納米醫療的私人化、以及將納米技術應用到現存的或者即將出現的治療模式中，我們會充分發揮納米醫療在治療腫瘤和其它疾病中的潛力。

表1 處于臨床階段的治療腫瘤的納米顆粒的例子

表2 老鼠腫瘤模型中納米顆粒輔助結合治療的例子

3、可預測醫療中的EPR

盡管在發展非侵入式納米顆粒給藥（如口服、肺、鼻、或經皮給藥）方面做了很多努力，目前大部分的納米治療藥劑是通過靜脈注射再經全身遞送到達腫瘤的。納米顆粒在腫瘤的優先富集經常被歸功于腫瘤中有缺陷的血管和受損的淋巴：畸形的腫瘤微血管增強了可滲透性從而使納米顆粒能夠進入腫瘤的間隙，而受到抑制的淋巴引流則使納米顆粒能夠滯留在組織中。EPR是納米顆粒運輸到實體腫瘤的基礎，然而越來越多的證據表明EPR不僅在不同病人和不同腫瘤中表現不一樣，同一病人或腫瘤中的EPR也會隨時間變化。但是探討EPR對納米治療效率影響的研究還很少，幾個前臨床研究表明有必要按照納米顆粒通過EPR富集的難易程度將病人分類，預示著EPR中可預測的生物標記物可能對納米醫療的臨床成功起到重要作用。

在我們前面關于EPR的綜述中，我們討論了TME的參數，其中某些參數與納米顆粒的作用已經被很好表征，而其它的則仍然是有待研究的“黑匣子”。最近腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）在納米顆粒-TME作用中起到的作用受到重視，TAMs也被認為是納米治療藥劑的倉庫，有效的治療藥物從中逐漸釋放到附近的腫瘤細胞中。最近有研究者用高分辨活體成像光譜技術系統地研究了兩種不同納米顆粒的滲透和其在腫瘤內的分布：臨床許可的30nm磁性納米顆粒ferumoxytol（MNP）和90nm的PLGA--PEG聚合物納米顆粒。盡管尺寸和成分不同，同時進行靜脈注射后它們表現出相似的藥物動力學，以及在腫瘤細胞和TAMs中有不同程度的共同富集。進一步將MNP和加載紫杉萜的PLGA--PEG共同注射后，腫瘤間的MNP水平受到納米顆粒載藥水平的顯著影響，所以MNP的富集水平成功預測了治療性聚合物納米顆粒的治療效率。最近的一項研究評估了將ferumoxytol作為預測納米脂質體-依立替康MM-398治療效果標記物的可能性。對6個癌癥患者病變尺寸減少的分析表明它們（減少的尺寸）與24小時后病變區域中的ferumoxytol水平呈現正相關（圖3a）。

用放射性同位素（如¹¹¹In、^99mTc、¹²³I?和⁶⁴Cu）標記的治療納米顆粒也被用來監控納米顆粒的生物分布和腫瘤富集，使用的成像方法包括單光子發射計算機斷層掃描（SPECT）、計算機斷層掃描（CT）、正電子成像技術（PET）。最近的臨床研究表明腫瘤中脂質體-阿霉素（LD）的富集水平與與病人的響應和存活率正相關（病人患有不可切除的胸膜間皮瘤并且用LD和順鉑共同治療）。用⁶⁴Cu標記的脂質體對犬類腫瘤進行PET-CT成像同樣顯示出了腫瘤富集的異質性，7個腫瘤患者的中的6個表現出了高的脂質體吸收效率，而4個肉瘤患者只有一個表現出高吸收。這些結果突出了放射性同位素標記的治療納米顆粒在評估病人對納米療法適應性中的作用（圖3b）。盡管在治療納米顆粒中加入造影劑也能夠用來研究腫瘤異質性和EPR，這些納米顆粒在設計、合成、規模化、監管方面的復雜性會增加。

除了發展成像納米顆粒作為治療效率的標記物以外，有些研究已經致力于確定可以預測EPR的基因、蛋白或者細胞生物標記物（圖3c）。循環中基質金屬蛋白酶9（MMP9）和基質金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP1）的比率、血管中的膠原蛋白含量被證明可以預測脂質體的EPR。與血管再生相關的循環生物標記物已經被介紹，如血管生成因子（血管內皮生長因子A、成纖維細胞生長因2、MMP9、白細胞介素-8、白細胞介素-6和肝細胞生長因子）、蛋白質和肽（如內皮抑素和腫瘤抑素）、內皮細胞和內皮祖細胞。然而它們與其它潛在生物標記物在預測EPR中的作用還有待在臨床研究中驗證。

圖2 納米顆粒性質對系統運輸的影響

（a）納米顆粒可以用不同材料制備，擁有不同的物理化學性質（如尺寸、幾何形狀、表面性質、彈性和硬度），以及能修飾不同密度的不同種靶向配體；
納米顆粒的性質會影響輸運時的生物過程，包括（b）與血清蛋白的相互作用，（c）血液循環，（d）生物分布，（e）滲透入血管周圍腫瘤微環境和穿透腫瘤，（f）腫瘤細胞靶向和胞內運輸；
（g）納米顆粒可以具有控制釋放行為。（注：ID代表注射劑量）

4、增強藥物輸送到腫瘤

4.1 納米顆粒-蛋白質相互作用

當納米顆粒進入到生物環境中（如血液、細胞間體液和細胞外基質），它們的表面會迅速被生物分子覆蓋（主要是蛋白質），形成“冠冕”（圖2b）。吸附的蛋白質改變了顆粒的尺寸、穩定性和表面性質，更重要的是為納米顆粒提供了一個決定其所能引起的生物響應的生物身份（這種響應包括細胞攝取、胞內輸運、藥物動力學、生物分布和毒性）。如調理素的吸附使得納米顆粒被單核吞噬細胞系統識別和清除，相反富含不良調理素（dysopsonin）蛋白（如阿樸脂蛋白和白蛋白）的冠冕，由于這些蛋白可以抑制吞噬細胞的攝取，從而增強了納米顆粒的隱蔽效應。盡管配體修飾的納米顆粒形成蛋白質冠冕后可能會失去靶向性，用某些特定的血漿蛋白修飾納米顆粒能提高其對某些器官的靶向性。最近的一個例子表明阿樸脂蛋白E對siRNA脂質體在體內靶向肝細胞至關重要。相反納米顆粒-蛋白質相互作用在臨床中也可能通過激活補體系統引起過敏反應。

應用多種分析技術，幾個實驗已經廣泛表征了某種納米顆粒（如金、二氧化硅、聚苯乙烯納米顆粒和脂質體）上的蛋白質冠冕（如其成分、密度、構型、厚度、親和性和動力學）。現在已經清楚納米顆粒-蛋白質相互作用高度依賴于納米顆粒的物理化學性質、暴露時間、蛋白質來源和濃度。然而我們還是不怎么了解納米顆粒性質（圖2a）和吸附的蛋白質類型（圖2b）跟特定的生理反應之間的關系（圖2c-f）。通過對105種不同金納米顆粒表面吸附的白蛋白進行表征，建立了一個定量的多變量模型來預測納米顆粒與細胞的相互作用。17種脂質體的蛋白質冠冕和物理化學性質最近被用來預測納米顆粒與不同癌細胞的生物作用（包括細胞攝取和存活率）。不同人類疾病對蛋白質冠冕成分的影響，以及其對納米顆粒細胞攝取和毒性的影響也引起了人們的關注。然而大部分的研究關注體外的納米顆粒-蛋白質相互作用，在體內以及其對藥物動力學、生物分布和治療效率的影響的研究則很少。值得注意的是，僅有的體內評估蛋白質冠冕的試驗表明體內和體外試驗結果有明顯的差別。

我們相信解決下面的問題會促進這個領域的發展：我們是否需要使用特定的蛋白質基因敲除小鼠來驗證和解釋體外試驗和正常老鼠身上的試驗結果？除了廣泛研究的血清中的蛋白，其它生理環境中的蛋白（如TME）會對冠冕、納米顆粒-腫瘤細胞相互作用以及納米顆粒穿透腫瘤細胞外基質有什么樣的影響？我們需要怎樣的新技術來更精確的表征和定量蛋白質冠冕？我們期望通過將定量的結構-反應性關系的方法論拓展到其它納米平臺和生物響應中，這種方法會加深我們對納米-生物界面的理解和控制，幫助設計出安全、高效甚至病人特異的納米醫療。

圖3 預測EPR和治療效率的潛在標記物

（a）顯像劑被用來預測納米顆粒的富集和抗癌活性；
（b）在前臨床和臨床中使用顯像劑標記的治療性納米顆粒（稱為治療診斷納米顆粒）來監控生物分布和腫瘤富集；
（c）血清和組織生物標記物也能作為EPR的標記物，正如腫瘤中的脂質體富集與基質金屬蛋白酶9和金屬蛋白酶抑制劑1比率的關系所展示的那樣。

4.2 血液循環

納米顆粒從微血管滲透入TME的效率與其在血液中循環的半衰期有關（圖2c）。對于血流量大并且納米顆粒容易滲透微血管的組織來說，只需相對短的循環半衰期就能使納米顆粒達到所需的富集；相反，對于低灌注或者納米顆粒不易滲透微血管的組織，就需要長的循環半衰期來確保有效的滲透。

納米顆粒與血清蛋白的非特異相互作用是限制循環時間的一個主要因素，它能增強調理素作用和被單核細胞吞噬系統識別。在納米顆粒表面嫁接PEG是應用最廣泛的增強循環周期的方法，比如Doxil，它的循環半衰期接近兩天。雖然PEG化納米顆粒能夠通過其親水性和空間排斥效應減少蛋白質的吸附從而避免被單核細胞吞噬系統清除，這個用于隱蔽長循環周期顆粒的過于簡單的方法正在變得過時（這個概念在25年前提出，“Stealth”現在是Liposome Technology, Inc.的一個商標）。例如，增加金納米顆粒表面的PEG密度能降低吸附量以及改變吸附蛋白質的種類，從而減少被吞噬細胞攝取；聚苯乙烯的PEG化被證明能夠選擇性增強叢生蛋白的吸附，有助于減少吞噬細胞的非特異吸收。納米顆粒的機械強度和彈性對單核細胞吞噬系統清除也有影響。

另一種增強納米顆粒的血液循環周期的策略是用本征標記物（self marker）來修飾納米顆粒，本征標記物能夠防止單核細胞吞噬系統的激活從而保護正常細胞。自下而上的方法是將本征標記物（如CD47肽）化學地共軛到納米顆粒的表面，從而抑制吞噬作用；自上而下的方法是用紅細胞、白細胞、血小板等薄膜包裹納米顆粒，從而“隱蔽”納米顆粒不被單核細胞吞噬系統清除。雖然包裹細胞薄膜的納米顆粒的循環周期比“裸”顆粒強，但還是比細胞本身短得多，因此還需要研究細胞包裹納米顆粒后其自身細胞膜的改變，包括成分和彈性。

4.3 滲透入TME

納米顆粒從血液循環中滲透入腫瘤的過程受到腫瘤血管畸變、血管周圍TME和納米顆粒本身的影響。腫瘤細胞的快速分裂所需的新陳代謝導致結構上畸變的新血管的生成。不像正常血管中的內皮細胞用1000天來更新自己，腫瘤中的內皮每隔10天就翻一番，因此形成的微血管沒有確定的形貌，包括特殊的小靜脈、小動脈和毛細血管等。對于發炎來說，免疫細胞的滲透主要發生在小靜脈層次，而對腫瘤新生血管中的每一部分對滲透性的貢獻還所知甚少。除了炎癥調節因子（如組氨酸）外，緊密連接調制子（如陽離子聚合物）與內皮細胞的相互作用也會導致內皮細胞收縮和緊密連接解體，從而導致血管滲漏。對于腫瘤來說，血管通透性和血液流速很復雜，并且不同部分在動力學上也不同。血管通透性隨時空的變化能部分的用腫瘤血管壁上瞬時打開和關閉的孔來解釋（稱為動態孔），對于循環周期足夠長的納米顆粒來說，動態孔能夠促進納米顆粒運輸到腫瘤（尤其大顆粒），另外血管調節因子（如一氧化氮、血管緊縮素Ⅱ）也能增強血管的通透性。血管和TME的不同部分的血液流速和膨脹壓也有差別，影響了納米顆粒進出腫瘤間質組織的運動。更深入的研究會幫助我們理解納米顆粒滲透入腫瘤的機制，改善制備和設計策略從而使納米顆粒更好地富集。

納米顆粒的物理化學性質對其滲透性和富集也有影響，比如在鼠科結腸腺癌中，30、50、70、100 nm的聚合物囊泡具有相似的滲透性和抗癌活性，而在胰腺癌中，只有30nm的顆粒能被有效富集。這項研究進一步說明腫瘤異質性對治療效率的影響，突出了個性化醫療的重要性。與球形納米顆粒相比，一些長的納米結構（如納米蟲、納米棒）能提高腫瘤富集效率。非球形納米顆粒與球形或半球形納米顆粒相比更傾向于富集和粘附在血管壁的內皮細胞上，增強位點特異的輸運。

另外一些獨特的策略也被提出用來增強納米顆粒的滲透性，利用某些細胞（如間充質干細胞、吞噬細胞、單核細胞）的腫瘤靶向性，將納米顆粒吸附到這些細胞的表面或者加載到細胞中就能靶向癌細胞。最近一種新的方法用兩種“通訊（ communicating）”的納米顆粒來增強腫瘤靶向性和富集：“信號發射”的金納米顆粒通過光熱效應破壞腫瘤血管壁引發血管外凝血，循環中的“信號接收”納米顆粒識別這個信號而粘附到血塊中。

4.4 腫瘤穿透

盡管強調滲透和富集在納米顆粒輸運中的重要性，深度并且均勻的腫瘤穿透對治療效率也有影響。對大分子（如右旋糖苷、抗體）的研究表明尺寸和結合親和性對擴散動力學和組織穿透深度有影響。比如對癌細胞表面抗原具有更高親和力的抗體的穿透能力更低，因為結合力強的抗體會跟目標緊緊結合從而被內化，而結合力弱的抗體則能擺脫目標而穿透得更深。從關于抗體的研究中我們能學習如何設計腫瘤靶向的納米顆粒，比如說在表面修飾靶向配體能增強細胞吸收和納米顆粒在組織的停留時間，但是它也會降低腫瘤的穿透深度。

治療納米顆粒通常會比抗體大，傾向于被微血管附近的細胞外基質捕獲（圖2e）。遇到的困難包括TME的內在障礙（如由膠原蛋白和其它蛋白組成的稠密的間質基質）、增強的組織間隙液壓（由畸形血管的高滲透性和缺失淋巴組織導致）。血管周圍的基質細胞（如TAMs）的非特異性吸收也會阻礙納米顆粒的擴散。值得注意的是腫瘤中毛細血管的平均間隔為80到幾百微米，是納米顆粒到達腫瘤的又一個障礙。

為了增強腫瘤穿透能力，一種可行的方法是調節納米顆粒表面的物理化學性質使其能穿透間質基質的擴散障礙。小顆粒能更好的在腫瘤中擴散，但太小的顆粒（如小于5nm）會被腎過濾快速清除。并且小顆粒有很大的比表面積、藥物在其中的擴散也很短，因而限制了它們的載藥量和控制藥物釋放的能力。納米棒（15nm×54nm）比直徑35nm的球形納米顆粒能更快穿透腫瘤，這可能與它們具有更小的維度有關，盡管它們的流體動力學直徑接近并且在水中的擴散速率幾乎相等。另外，用腫瘤特異的穿透性蛋白（如環肽CRGDK/RGPD/EC）修飾也可以增強納米顆粒的腫瘤穿透力。用實時活體成像技術系統的研究納米顆粒-TME相互作用能夠確定擁有最優滲透性的納米顆粒所需的性質。TME改性的方法，如降解腫瘤的細胞外基質、抑制腫瘤相關成纖維細胞的活性從而減少基質組分的合成，也有助于納米顆粒穿透腫瘤組織。

最近提出了一種新的多步輸運策略來克服穿透問題，小分子藥物共軛體（SMDCs）、微型生物藥物共軛體（mBDCs），其中包括肽-藥物共軛體，被用來解決抗體-藥物共軛體尺寸大的缺點，正是大尺寸限制了它們的穿透性。 SMDCs 和mBDCs與自由藥物相比能夠增強腫瘤的停留和細胞吸收。但是它們的缺點（如藥物動力學差）可能會影響它們的治療效果。通過將 SMDCs和mBDCs引入到聚合物納米顆粒中組成多步輸運系統，能夠結合納米顆粒（藥物動力學好、腫瘤富集能力強）和 SMDCs 與mBDCs（穿透能力強、腫瘤細胞特異靶向）的優點從而獲得最好的治療效果。

也有報道提到了相似的多步輸運系統，他們首先將非常小的納米顆粒（如10nm的量子點）加載到大顆粒中（如3.5μm的半球形介孔硅、100nm的白明膠納米顆粒），當大顆粒到達腫瘤血管或者暴露在TME中，小顆粒被釋放出來，接著擴散到腫瘤中。

4.5 細胞吸收和胞內運輸

有效的細胞內化對增強納米顆粒的滯留、EPR和治療效率（由于很多納米醫療作用于細胞內的目標）也很重要，特別是對運輸生物大分子（如siRNA、miRNA）來說。增強細胞吸收的方法之一是用能識別癌細胞表面特定受體的靶向配體修飾納米顆粒（圖2f），當EPR失效（如血管靶向）或者治療藥劑的運輸需要激活生理障礙的轉胞吞作用（如腸粘膜、血-腦屏障）時主動靶向就很重要了。由于納米顆粒主動靶向在30多年前就被提出來了，現在一些樣品已經進入了臨床試驗階段，包括靶向脂質體（如HER2）、第一個靶向并且可控釋放的聚合物納米顆粒（BIND-014）、第一個靶向siRNA納米顆粒（CALAA-01）。甚至在沒有靶向配體的情況下，也可以通過調節納米顆粒的尺寸和形狀來增強腫瘤細胞的吸收。

另外，研究癌細胞變異對納米顆粒內化的影響也很重要。KRAS 變異的胰腺癌細胞對蛋白質（如白蛋白）的巨胞飲能力增強，并且在谷氨酰胺饑餓后細胞外白蛋白增強癌細胞增殖的能力也取決于致癌基因KRAS的表達。這項成果表明聚胞飲能夠增強藥物的吸收（如將紫杉醇吸附在白蛋白中），也部分解釋了為什么用這種顆粒（白蛋白-紫杉醇）治療晚期胰腺癌能取得成功。這種基因突變是否對納米顆粒的內吞作用有影響還不清楚。應該注意，我們現在對納米顆粒-細胞相互作用的理解主要來源于體外實驗，它是否反映體內癌細胞的異質性還不清楚。最近在高分辨活體細胞成像技術方面取得的進展使得我們能夠仔細分析單細胞的藥物動力學和細胞-細胞間的不同，并且有望應用于在活體內觀察納米顆粒與腫瘤細胞和TME的相互作用。

納米顆粒內化后，必須釋放治療藥物使他們擴散到達靶向目標或者通過胞內運輸通道的引導到達適當的亞細胞區域再釋放藥物。對于生物大分子（如siRNA）的運輸，納米顆粒的內涵體逃逸至關重要，陽離子脂質和類脂質材料、聚合物基納米顆粒運輸siRNA有很大的潛力，臨床試驗中治療癌癥的RNAi納米藥劑主要由脂質體或脂質納米顆粒組成（表1）。雖然目前這些基于脂質的納米顆粒沒有修飾配體用于主動靶向，能靶向的納米顆粒會進一步增強腫瘤富集、滯留和siRNA的細胞吸收。盡管在臨床試驗上的成功，脂質納米顆粒輔助siRNA從內涵體的釋放效率還很低（1-2%），大約70%內化的siRNA會經歷胞吐，因此需要發展一種能夠高效逃離內涵體的納米顆粒。除了細胞溶質運輸外，有時也要靶向細胞器（如細胞核、內質網、核糖體、高爾基體），雖然能被細胞器特異吸收的納米顆粒已經被開發出來，細胞器膜對納米顆粒運輸的阻礙作用還需進一步研究。

4.6 可控藥物釋放

一個同樣重要但是經常被忽略的因素是：全身給藥的納米顆粒在循環過程中會逐漸釋放其中的藥物（圖2g），經過長期循環到達TME后納米顆粒的載藥量會降低。因此實現最優的治療效果需要同時考慮藥物釋放、納米顆粒的藥物動力學、納米顆粒的滲透。

我們認為設計最優的納米系統需要深入理解幾個復雜的參數：納米顆粒動力學和藥物動力學相互影響、被包裹藥物和已經被釋放藥物的相互影響、藥物Cmax和納米顆粒Cmax之間的相互影響、藥物AUC和納米顆粒AUC的相互影響；以及對血清和腫瘤藥物動力學和AUC影響不同的因素。傳統的小分子藥物在血漿中的含量在靜脈輸注期就會達到最大值，隨后逐漸降低，而在使用納米顆粒包裹藥物使其可控釋放時，被釋放的藥物在血漿中的含量開始會非常低，隨后慢慢增大，最后在循環時達到最大值，更重要的是后者的最大值不太可能達到前者的最大值，因此納米顆粒會降低與最大藥物濃度相關的毒性。另一方面，自由藥物和納米顆粒釋放藥物的AUC很相似，只有一個主要的不同點：它們的形狀不同，納米顆粒控制藥物釋放的圖形（血漿中藥物濃度與時間的關系曲線圖）很寬很平緩，而自由藥物的圖形會出現一個陡峰和長的尾巴。因此它們與AUC相關的毒性相似，甚至納米顆粒的會更難克服。用納米顆粒運輸藥物時，腫瘤內的藥物動力學和AUC會跟用傳統方法給藥的非常不同，部分是由于EPR導致納米顆粒在腫瘤的富集比自由藥物的大的多，并且由于局部的納米顆粒將藥物釋放出來使腫瘤中的藥物含量長期比自由藥物的高。大部分的出版物都證明納米顆粒增強了藥物運輸到腫瘤的效率，部分的研究表明隨著時間的推移腫瘤內的藥物最大含量、藥物動力學和AUC會比自由藥物有所改善。但是提高藥物在腫瘤中的富集并不一定會改善病人的總存活數，這就產生了幾個問題：這種富集是普適的還是只對某些人群適用？是否對全部藥物來說提高其在腫瘤中的濃度都是有益的，還是對部分藥物適用？

為了精確控制藥物的釋放，發展了一系列刺激響應的納米顆粒，這些納米顆粒通常會對與TME和腫瘤細胞相關的細微改變敏感（如pH、氧化還原狀態、酶），或者能被外部刺激激活（如光、熱、磁場、超聲波）而釋放藥物（圖2g）。在某種程度上，外部刺激能在時間和空間上控制藥物的釋放。熱響應脂質體（如ThermoDox）控制藥物釋平臺放是目前最先進的臨床階段平臺。2013年，ThermoDox在肝細胞癌非擴散存活率的第三階段試驗中達不到主要終點的要求，而現在正在進行以總存活數為主要終點的第三階段試驗。更加新型的刺激響應納米材料包括pH或氧化還原敏感的聚合物納米顆粒、超聲波響應的嫁接聚合物的二氧化硅納米顆粒、近紅外光響應的氧化石墨烯納米片，這些系統的臨床表現還有待研究。

5、靶向TME和腫瘤細胞轉移前微環境

由于TME在腫瘤發展、擴散、轉移、耐藥性的出現中扮演重要角色，它也成為治療腫瘤的靶向目標。如前所述，TME改性是增強納米顆粒腫瘤富集和穿透性的可選方法之一。與靶向腫瘤細胞相比，靶向TME中的非腫瘤細胞的一個好處是它們基因上更穩定因此更不容易形成耐藥性。然而靶向非腫瘤細胞的困難在于減少對正常細胞毒性的同時獲得良好的治療效果。TME改性如何影響腫瘤生長和轉移還需進一步研究。除了原發性腫瘤的TME外，轉移癌細胞存活和增殖所需的環境也成為新型治療方法的目標，對早期形成的腫瘤細胞轉移前微環境進行干擾可能對于治療傾向于轉移的惡性腫瘤特別有用。

5.1 腫瘤血管

很多研究致力于用納米顆粒將藥物運輸到對腫瘤的生長和轉移非常重要的血管中（圖4a）。這經常通過配體修飾納米顆粒實現，這些配體能與腫瘤內皮細胞表面過度表達的適體（如αvβ3 整合素）發生特異性結合。體內研究表明抑制血管再生能使現存腫瘤消退或者抑制其轉移。除了靶向納米顆粒，幾種非靶向的陽離子脂質或者聚合物納米顆粒也被設計用于將siRNA優先運輸到血管內皮細胞。一種叫做7C1的新配方在使用低siRNA劑量時能有效降低目標內皮細胞的基因表達，而不會影響它們在肺免疫細胞、肝或腹腔免疫細胞中的表達，通過沉默參與血管再生的VEGE受體1和類三角洲蛋白4，7C1納米顆粒降低了小鼠體內路易士肺癌的生長和轉移，這個有趣的系統也能用于研究材料與血清蛋白的相互作用如何引導納米材料到內皮細胞中。

圖4 納米顆粒靶向腫瘤微環境和轉移前腫瘤微環境

（a）靶向腫瘤微環境中的血管或者基質細胞；
（b）靶向轉移前腫瘤微環境，如骨髓；
（c）用配體修飾納米顆粒能夠使其進行細胞特異的靶向，這些配體能夠與腫瘤內皮細胞、基質細胞或其它靶向細胞表面的受體結合。應該注意，即使沒有配體，也能使納米顆粒被某些細胞優先吸收。

5.2 基質細胞

靶向基質細胞（如腫瘤相關成纖維細胞、巨吞噬細胞）也被用來進行癌癥治療（圖4a）。一種叫做Cellax的紫杉萜共軛納米顆粒能有效耗盡表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的成纖維細胞，降低腫瘤中的ECM和IFP，增強血管通透性和抑制腫瘤轉移。這個效應可能是通過在Cellax吸附血清白蛋白，隨后與α-SMA+成纖維細胞（同樣過度表達白蛋白結合蛋白質）發生特異作用，分泌酸性的富含半胱氨酸的糖蛋白。腫瘤相關巨吞噬細胞（TAMs）分化為致癌或抑制免疫反應（類M2）的顯型經常被與腫瘤轉移或者不好的結果相關聯。通過抑制信號傳導子及轉錄激活子的活性，加載肼基姜黃素的納米顆粒能夠“改造”TAMs，使其由類M2顯型轉化為抗腫瘤發生的M1顯型從而抑制腫瘤的生長。用PEG隱蔽、甘露糖修飾的納米顆粒能有效靶向過度表達甘露糖受體的TAMs，同時MPS中巨吞噬細胞的吸收量最低。基于納米顆粒的同時運輸多種組分的藥劑能夠同時靶向TME和腫瘤細胞從而實現協同的抗癌效果。

5.3轉移腫瘤微環境

一種新發展的由聚合物-藥物共軛體組成的聚合物囊泡對小鼠肺轉移的結腸癌和人類肺轉移和骨轉移的去勢抵抗性前列腺癌有很好的效果。用納米技術來改變腫瘤轉移前微環境和抑制腫瘤生長的研究還很少。在一項最近的研究中，骨歸巢聚合物納米顆粒被用來在時間和空間上控制藥物的釋放（圖4b）。用共軛阿侖唑奈、加載硼替佐米的聚合物納米顆粒預處理后，小鼠表現出更慢的骨髓瘤生長速率和更長的壽命，通過理解微環境中控制腫瘤轉移細胞滲透、吸附和生長的因子以及它如何實現，能夠進一步發展這種用預處理來保護容易發生腫瘤轉移的器官的方法。

6、臨床轉化中的挑戰

6.1 可控和可重復的合成

確定最優的物理化學參數對治療性納米顆粒的成功至關重要。關于能影響有效免疫逃逸、腫瘤滲透和擴散、細胞靶向和內化、藥物可控釋放的單個因素的研究已經很多，然而對納米顆粒的眾多性質進行系統的平行篩選還是很困難的，由于快速、精確、可重復合成相同的納米顆粒存在困難。與傳統的體相技術相比，微流體技術由于能高速自組裝尺寸分布窄、物理化學性質可調、可重復性好的納米顆粒而受到關注。同樣非潤濕模板復形法能夠合成尺寸、形狀、化學成分、表面性質和載藥能力高度可控的單分散納米顆粒。這種方法能夠幫助發現納米顆粒，類似于小分子高產量篩選技術促進藥物的發現。

6.2 評估與篩選

隨著由新型生物材料或者納米結構組成的納米顆粒的迅速涌現，在開始動物實驗前很重要的一步是在體外實驗中篩選生物相容性好的納米顆粒，體外實驗也能加深我們對納米顆粒-細胞相互作用的理解。然而由于傳統的體外實驗模型使用的是用多井板培養的細胞，它缺乏生物組織的復雜性和流體流動的控制，這種平臺可能重復不了納米顆粒與生物屏障之間復雜的相互影響。最近在發展仿生“器官/腫瘤芯片（organ/tumour-on-a-chip）”方面所做的能力可能克服體外實驗的不足。將類腫瘤球體加入微流體通道中能夠幫助我們理解間隙流動、細胞粘附、顆粒尺寸對納米顆粒富集和擴散的影響。將納米顆粒在這種芯片中的行為與其在動物模型的行為做對比可能幫助我們了解這些仿生微裝置的潛力。

為了評估納米顆粒在體內試驗的性能（如藥物動力學、生物分布、效率和安全性），必須使用動物模型。盡管有些研究表明不同納米顆粒在不同物種間的藥物動力學有一定的縮放（scaling），一個很清晰的障礙是前臨床試驗和臨床試驗結果的差異，很大程度上是因為缺少能夠完全復制人類腫瘤的腫瘤模型。現在有很多種可用的動物模型，包括基于細胞系的皮下和原位異種移植、病人衍生異種移植（PDXs）、基因工程的老鼠模型（GEMMs）。然而沒有單一的模型能夠復制人類腫瘤的全部信息，EPR在動物模型中會比在癌癥病人中更加一致。進一步考慮到腫瘤轉移對死亡率的影響，腫瘤轉移模型對于研究EPR和納米顆粒穿透來說會比原發性腫瘤更加有用。納米醫療的轉化可能會大大得益于能夠精確模擬人類腫瘤的異質性和解剖組織學的模型的發展，如PDXs、人類化的老鼠模型、GEMMs。

6.3 規模化生產

阻礙納米顆粒臨床發展的又一困難是從前臨床到臨床再到商業化的過程中，在化學、制造和控制（CMC）、好的制造實踐（GMP）等方面逐漸提升的復雜性。雖然CMC和GMP的共同目標是確保產品在符合質量標準方面的一致性，但它們使用的方法和遵守的規則不同而又部分重疊。簡單納米顆粒（如脂質體）的規模化可以使用制藥工業廣泛使用的制造單元操作來實現，更復雜的納米醫療對CMC和GMP提出了更高的要求，需要修改現存的單元操作或者發展新的制造過程。例子包括加入了生物的靶向配體或生物組分的納米顆粒、同時加載幾種組分的納米顆粒、需要一層一層組裝或者有多種功能（如診斷和治療）的納米顆粒。

通常，當納米顆粒涉及到多步或者復雜的技術時其大規模和可重復合成會更加困難。從實驗室到臨床轉化的過程中經常會伴隨著參數的優化，甚至方法的改變，所以在早期設計納米顆粒時考慮規模化問題至關重要。非潤濕模板復形法的可重復性好，但Kg量級的生產還有待研究。同軸湍流射流混合技術是最近發展起來用于大規模（可能達到3Kg每天每通道）生產聚合物納米顆粒的技術，它具有通常只有在微尺度混合技術（如微流體裝置）中才能擁有的均勻性好、可重復性好、可調節性好等優點。雖然現在大部分的納米顆粒還是使用體相合成法來制造，新的技術如非潤濕模板復形法和同軸湍流射流混合技術能夠高產量生產納米顆粒，它們有可能加速臨床轉化。

7、結論

如同很多在過去幾十年中變革了醫學行業的科學進步一樣，腫瘤納米醫療必須先成熟起來才能發揮它的全部潛力。增進我們對腫瘤異質性的了解以及確定新的EPR標記物使得我們能夠對病人做出選擇以使其對納米醫療做出最大的響應。對納米-生物相互作用、納米顆粒系統輸運到腫瘤細胞、納米顆粒靶向TME或者腫瘤轉移前微環境的全面了解有利于實現更安全高效的納米醫療。解決納米顆粒在合成中遇到的可控、可重復、可規模化等難題，以及對納米顆粒進行篩選和評估，都將有利于臨床發展。雖然大多被許可的納米醫療加載的都是現存的藥物，我們期望下一代納米醫療可以更多地加載新的分子（如激酶抑制劑）和新型治療劑（如siRNA、mRNA和基因剪輯）。

總之，我們快速獲得了對腫瘤納米醫療所面臨的機遇和挑戰的更深理解。本綜述探討了將納米技術與腫瘤生物學融合對納米醫療發展和臨床轉化的重要性。我們期望納米醫療會改變治療腫瘤的模式，以及腫瘤納米醫療的最終目的—極大的提高病人的存活率會在不久的將來變成現實。

文獻鏈接：Cancer nanomedicine: progress,challenges and opportunities（Nature review cancer,2016,DOI:10.1038/nrc.2016.108）

本文由材料人生物材料組陳昭銘供稿，材料牛編輯整理。

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