施劍林課題組Chem.Rev.最新綜述: 用于成像和治療腫瘤缺氧的功能化探針的化學設計和合成

【引言】

腫瘤中的缺氧發育與其侵襲性和強烈的治療抗性密切相關，這會導致幾種類型的癌癥預后不良。臨床上常常使用侵入性氧微電極和高劑量放射線來準確檢測和有效地對抗缺氧。但是最近出現了旨在開發可用于非侵入性成像和有效治療缺氧性腫瘤的功能分子和納米材料的跨學科研究。

近日，來自上海硅酸鹽所的施劍林研究員和劉佳男助理研究員以及上海硅酸鹽所研究員、華東師范大學教授步文博（共同通訊）概述了迄今為止發布的關于缺氧性腫瘤成像和治療的報告。首先，以熒光成像、正電子發射斷層掃描、磁共振成像和光聲成像的順序，介紹了可以非侵入式應用于圖像缺氧的各種缺氧反應探針的設計理念。總結了可用于有效治療腫瘤缺氧的最新功能納米材料，最后還討論了該領域研究人員面臨的挑戰和未來前景。上述內容以“Chemical Design and Synthesis of Functionalized Probes for Imaging and Treating Tumor Hypoxia”為題發表在了Chemical Reviews上。

綜述導覽圖

1 簡介

當腫瘤以過大的方式生長時，腫瘤的內部的血液供應遠遠不足，導致氧氣（O₂）的輸送被大大抑制。這種不足的氧氣供應幾乎不能滿足積極增殖的腫瘤細胞不斷增加的代謝需求，使得瘤內微環境顯著缺氧。因此，缺氧是所有實體瘤的常見特征。在過去二十年中，相當多的研究已經證明，缺氧性腫瘤患者生存率顯著降低。

為了對抗缺氧，需要有效的方法來可靠地檢測甚至成像腫瘤缺氧。準確的缺氧成像將使臨床醫生不僅能夠找到那些缺氧的荷瘤患者，并且定位缺氧，還可以制定合適的治療策略，從而有助于治療結果的改善。臨床上，O₂針電極法通過將細針電極插入容易獲得的腫瘤部位作為標準，使得研究者能夠定量地進行局部O₂濃度的精確測量以及找出幾個特定的軌跡。而且，更有利的是，可以采用非侵入性方法來精確地映射目標區域的缺氧異質分布。

2?低氧敏感熒光探針

2.1?感應氧化還原狀態

據報道，低氧微環境中的低O₂濃度可能會引發各種還原物質如黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的積累。這些物質將導致剩余O₂的減少，從而產生過量的活性氧（ROS）。另外，由于正常的腫瘤細胞進行有氧糖酵解，因此常常產生來自葡萄糖的乳酸，而低氧性腫瘤中的缺氧會誘導細胞中的厭氧糖酵解作用。這個過程將導致乳酸和酸中毒的產生增加，導致酸性細胞外微環境（pH值：6.5-6.9）。結果，缺氧微環境具有增強的氧化還原、ROS和酸中毒的水平。

通常，缺氧程度與還原物質如硝基還原酶（NTR）和偶氮還原酶的局部濃度密切相關。因此，基于這些衍生物缺氧引發的分子切割特性，通過使用硝基芳族化合物，醌或偶氮苯（偶氮）衍生物作為缺氧敏感部分已經開發了許多光學探針。這些缺氧敏感探針通常是基于熒光共振能量轉移（FRET）構建的，其中FRET供體和FRET受體通過缺氧可裂解基團連接在一起。因此，可以采用分別在缺氧和正常情況下的FRET開關狀態來反映缺氧程度。

圖1?用硝酸還原酶活化的探針的催化發光示意圖

圖2?NADH還原探針的示意圖

圖3?基于偶氮探針的檢測機理和化學結構

2.2? 氧分子感測

通過開發含有氧化還原敏感性基團的缺氧探針，理論上可以監測缺氧程度。然而，當涉及具體應用時，由于它們不直接測量細胞pO₂，所以這些策略可能會受到其他氧化還原物質（如谷胱甘肽和半胱氨酸廣泛存在于癌細胞中）的很大影響。因此，開發低氧敏感性探針更為重要，可以將臨床相關區域（0-15 mmHg）內的pO₂值直接顯示，甚至可以在體外和體內準確地描繪O₂分布。

幸運的是，長期以來已經探索了可以被O₂分子淬滅的發光探針。光致發光的O₂敏感分子通常基于具有較長衰變輻射和壽命的染料，例如Ru²⁺絡合物，Ir²⁺絡合物和最近開發的基于卟啉的化合物，在光照射下，通過內部轉換和系統間交叉過程，指示器迅速放松至激發三重態。一旦與O₂分子接觸，激發的染料分子的一部分將通過與O₂分子的碰撞相互作用而淬滅，因為來自三線態的發射強度通常較低。結果，隨著氧濃度的增加，磷光的產率將隨著濃度依賴性的增加而降低。這種O₂誘導的磷光猝滅效應可用于O₂的直接和可逆感測。

圖4?在O₂誘導的磷光猝滅過程中主要能量轉換途徑的示意圖

通過利用這些O₂指示器，已經有許多基于單磷光發射強度變化的“ON-OFF”檢測開關的光學探針。盡管有吸引力，基于單個強度的報告信號并基于個體使用一個O₂敏感染料在實際應用中容易受到探針濃度、光散射和外部環境變化（如溫度或pH值）的干擾。 由于O₂濃度和熒光強度之間的實際關系總是不是線性的，沒有復雜數據處理的幫助，準確和定量地確定O₂濃度是非常困難的。

在過去十年中，研究人員已經開發出至少三種策略來克服上述缺點。一個有效的策略是依賴于復合探針的開發，該復合探針包含O₂非敏感染料和O₂敏感指示劑。這樣的探針可以通過同時記錄兩個波長的熒光強度來實現O₂濃度的測量，從而通過將強度比與O₂濃度相關聯來提供對環境影響的校正機會。檢測的一種更有效的方法是開發基于FRET的雙發射納米探針。通常，這些納米探針由熒光染料/納米顆粒組成，既作為FRET供體和熒光參照，又是O₂敏感的有機染料并用作發射感應信號的受體。預計供體的相對短波長的發射將激活受體以發射更長的波長，因此這兩個發射之間的比例可以通過O₂濃度來調節。第三種是磷光壽命成像，作為熒光團的固有特性，磷光壽命只能通過O₂濃度改變。因此，這種壽命信號不會受到細胞、器官或甚至體內發光分子的異質分布的影響。

圖5?通過開發量子點裝飾膜的光學O₂探頭的示意圖

圖6?用于比例測量活細胞中O₂濃度的分子探針的設計概念

2.3?同時感測氧氣和pH值

上述探針只能報告一種缺氧相關參數。然而，缺氧的物理和化學行為通常不僅僅由一個環境因素決定，是由兩個或更多個因素（如O₂濃度和pH）的相互影響在一起決定的。盡管缺氧與低氧濃度和酸中毒密切相關，但細胞外pH值和O₂濃度之間缺乏明確的空間相關性。為了更準確地闡明缺氧微環境，有必要探索能夠同時檢測多個環境參數的多功能熒光探針。

為了提供O₂濃度和pH值的精確測量，當將O₂和pH指示劑組合到一個系統中時，開發具有可分離發射波長的高通量發光探針是很好的選擇。從應用的角度來看，探針中的兩個熒光部分必須由單個光源激發。因此，它們的吸收光譜必須在一定程度上彼此重疊，而來自探針的兩個發射可以在空間上彼此分離，但不經歷FRET。矛盾的是，氣體傳感器通常因為它們的氣體透過性由疏水材料制成，而親水性材料需要感測pH。 因此，用于細胞內應用的這種多種納米探針的設計和構建是非常具有挑戰性的，以滿足對各個參數的獨特感測同時的多方面要求。

該問題的第一個解決方案是將兩個微粒與不同的滲透選擇性結合起來，以同時檢測酸度值和O₂水平。在該系統中，pH指示劑羧基熒光素被包封在由可滲透的聚甲基丙烯酸羥乙酯制成的顆粒中，而O₂指示劑釕（II）絡合物物理吸附在溶膠-凝膠基粒中。之后，將這兩種微粒分散在由水凝膠制成的基質中，最終同時允許光學檢測pH和O₂。

作為另一種解決方案，Wolfbeis等人 開發了基于聚合物的納米探針，高度生物相容的聚合物Pluronic F-127芯與聚乙二醇（PEG）連接以形成納米探針。鉑（II）內消旋-四苯基四苯并卟啉（PtTPTBP）作為親油性O₂敏感探針和五氟苯基卟啉（TFPP）同時包封在疏水核心。此外，pH敏感探針、發綠色熒光素異硫氰酸酯（FITC）與位于殼上的PEG基團共價連接。 Pt-TPFPP的紅色發光強度隨著pO₂的增加而降低，同時FITC的綠色熒光隨pH值的增加而增強。

圖7?O₂和酸性雙納米探針的化學結構示意圖

3?低氧敏感PET探針

雖然光學成像具有單細胞靈敏度的優點，但隨著成像深度的增加，其空間分辨率迅速下降。在臨床可用的成像方法中，MRI、計算機斷層掃描（CT）、PET和單光子發射斷層掃描（SPECT）由于其組織深度的獨立性而非常有吸引力。其中，通過在放射性示蹤劑探針的幫助下，通過提供無創和3D評估腫瘤缺氧程度。通常，缺氧標記應該能夠容易地和非特異性地進入癌細胞，僅在缺氧細胞中停留，而不在常氧細胞中。

通常，PET放射性示蹤劑由放射性同位素和對缺氧微環境特異性的缺氧反應性分子組成（例如由代謝產生的還原或葡萄糖）。Cu，¹⁸F，¹¹C和¹⁵O經常被選為放射性同位素，因為它們探針的低氧反應性部分可以分為兩組：硝基咪唑類似物和非硝基咪唑試劑。

3.1?硝基咪唑類似物

2-硝基咪唑類化合物被認為是PET缺氧成像的第一代分子探針。硝基咪唑可被動地擴散到腫瘤細胞中，隨后在正常氧條件下進行還原反應以形成中間產物，這些物質可以快速再氧化成母體化合物，導致細胞擴散。在缺氧條件下，硝基離子基團將繼續經歷生物還原過程，導致亞硝基雜環的持續產生,這種產生的物種最終將被捕獲在細胞中。

圖8?在缺氧條件下捕獲的硝基咪唑的機理示意圖

3.2?非硝基咪唑試劑

作為最常用的PET顯像劑，2-氟-2- [¹⁸F]脫氧-D-葡萄糖（[¹⁸F] FDG）已成功用于缺氧檢測。FDG PET缺氧成像的原理是基于葡萄糖代謝，利用腫瘤中上調的葡萄糖轉運蛋白和糖酵解酶，眾所周知的是Warburg效應。在缺氧條件下，線粒體中合成的ATP的量將減少，導致細胞糖酵解的刺激來補償能量供應。因為腫瘤的[¹⁸F] FDG攝取量與缺氧程度直接相關，所以FDG-PET被用作腫瘤缺氧標記物。然而，FDG保留與腫瘤缺氧程度之間的不準確相關性已經在許多臨床研究中被發現，因為大多數非低氧性腫瘤細胞也嚴重依賴于糖酵解ATP產生。因此，FDG作為特異性缺氧示蹤劑的潛在應用似乎受到限制。

圖9?缺氧誘導的⁶⁴Cu-ATSM形成用于PET成像的示意圖

圖10?¹⁸F-FAZA輔助PET圖像用于劑量繪圖

4?低氧敏感性MRI探針

4.1 T₂-MRI探針

迄今為止，還沒有關于缺氧敏感的T₂-MRI造影劑的報道，因為目前的超順磁性藥物的T₂-MR效應通常與缺氧微環境無關。幸運的是，血氧水平依賴性MRI（BOLD-MRI ）作為缺氧檢測方法能夠使用梯度回波序列跟蹤血氧飽和度。該方法的原理是基于以下事實： 由于血液中脫氧血紅蛋白含量的變化會改變水的松弛行為（特別是T₂ *），血紅素亞基內的鐵離子的狀態將從高pO₂處的抗磁性低自旋狀態變為順磁性，可以通過MRI測量血氧飽和度水平。在過去幾十年中，一些研究已經證明，BOLD效應與測量pO₂的標準呈現出密切的相關性。最近的報告也提出了BOLD-MRI技術對患者缺氧成像的可行性，其提供監測氧合波動的能力顯示出幾個優點，包括其無創性和對氧合水平變化的實時檢測。

4.2?T₁-MRI探針

雖然基于T₂-MRI的這些策略能夠將缺氧與常氧區分開，但由于BOLD和T₂-MRI影響與組織氧合不直接相關，因此它們仍然無法提供pO₂的定量測量。更糟糕的是，基于T₂-MRI的測量通過減少水的橫向自旋弛豫時間使信號減少。這種信號變弱效應可能與其他致病過程混淆，使得檢測結果不太可靠。幸運的是，與T₂ */T₂加權圖像相比，T₁加權序列能夠提供更高分辨率和信噪比的圖像，因為它們通過減少縱向自旋晶格弛豫時間使得有關地區似乎“更亮”。

?圖11?缺氧敏感探針的設計策略

圖12?MRI Gd-DOTP測繪實驗程序示意圖

4.3?¹⁹F MRI探針

如上所述，常規臨床MRI檢測¹H核的信號，其大部分位于人體內的水和脂肪中，其他活性核，如¹³C，¹⁹F，²³Na和¹²⁹Xe也可用于MRI檢測。其中¹⁹F MRI最近受到極大的關注，因為它具有與¹H相似的NMR靈敏度（83％的相似度），并且在¹H附近提供了最高的靈敏度。更重要的是，組織中的內源性¹⁹F濃度通常小于10^-3μmol/ g，一般低于檢測限¹⁹F MRI。 身體組織中缺乏背景信號使¹⁹F MRI具有較高的信噪比，在檢測到¹⁹F信號時，具有更高的特異性。

?圖13?兩個氟化氧化還原活性銅絡合物的示意圖

4.4?PARACEST探針

到目前為止，MRI可檢測的缺氧探針主要限于T₁松弛劑，這些一直被過度利用以達到所需的檢測靈敏度。在過去十年中，已經發現了一類新的具有高靈敏度的基于CEST的造影劑。為了使CEST發生，兩個池之間的質子交換率（k_ex）應該小于兩個池之間的化學位移差（Δω）。考慮到這個標準，用于增加Δω值的各種不穩定的含質子的配體如-SH、-OH和-NH已經與順磁鑭系元素或過渡金屬絡合物結合形成大多數PARACEST試劑。由于這種金屬離子的順磁效應，這些質子的¹H NMR信號顯示出非常大的化學位移，這取決于金屬離子和含質子配體之間的距離和幾何取向。

?圖14 Co²⁺/Co³⁺絡合物和CEST光譜的結構

4.5?低氧敏感雙模成像探針

雖然上述開發的針對缺氧的探針在未來的臨床應用中具有很大的潛力，但是由于探針濃度的波動引起的可能的假陽性對比，所以響應于缺氧的信號強度變化可能不會百分之百可靠。如果一個成像探針可以同時報告兩種成像模式的缺氧程度，則可以實現比單一成像模式更有說服力和準確的缺氧評估。特別地，能夠解剖和功能成像的雙模顯像劑將為缺氧的可靠臨床診斷提供強大的和互補的信息。

圖15?缺氧檢測通過MRI /熒光雙峰成像

5?低氧敏感光聲探針

光學成像能夠在生物組織中提供豐富的對比度，但遭受嚴重的光散射，從而導致不可避免的缺點，例如有限的組織穿透深度和嚴重的光學散焦。單個成像可以具有足夠的空間分辨率和較少限制的穿透深度。幸運的是，通過將激發的光子轉化為超聲能量，光聲層析成像（PAT）具有高穿透深度（幾厘米）和高空間分辨率的優點。吸收光子后，生物分子可以通過所謂的光聲效應，檢測到這種誘發的壓力波形成的PAT圖像。結果，PAT繼承了高超聲波分辨率和豐富的光學對比度的優點，但緩解了自身的缺點，使得解剖和功能成像同時成為可能。

圖16?PAT成像機理原理圖

6?治療腫瘤缺氧的治療劑

通常，大多數目前可用的治療策略，包括化學療法、RT和光動力療法（PDT），由于其獨特的微環境，在治療缺氧性腫瘤方面僅僅取得了有限的成功。令人不安的是，實體瘤中存在的缺氧也可以促進和加速惡性進展和促進轉移。因此，一旦可以鑒定出具有明顯的腫瘤缺氧的癌癥患者，則非常需要立即執行有效治療以克服缺氧誘導的化學治療和輻射電阻。在最近發展治療缺氧性腫瘤的基礎上，研究者將通過利用功能性納米材料及其結構設計來評價兩種治療策略。首先，設計了具有強大治療效果的各種納米劑，以克服腫瘤缺氧。例如，一種強大的納米吸收劑可以提供或產生敏化劑，使缺氧性腫瘤對治療敏感。另一種強大的納米藥物對腫瘤缺氧表現出協同的治療作用。更有趣的是，實驗中設計了幾個強大的納米器件，以使PDT工藝對環境的O₂濃度依賴小。第二，一些特殊的納米器件甚至可以利用缺氧作為缺氧性腫瘤反應性治療的有利因素。極具吸引力的是，一些最近設計的探針可以巧妙地應對缺氧微環境，以引發有效的治療。這些策略可以消除研究人員在治療缺氧性腫瘤方面面臨的障礙，這表明了癌癥治療的重大進展。

圖17?通過MnO₂和過氧化物之間的反應生成O₂

7 總結與展望

在本文中，對于敏感檢測和有效治療癌癥缺氧的功能探針的設計和構建的最新進展進行了總結和討論。在檢測缺氧的成果中，已經使用諸如熒光成像、PET、MRI和PAT之類的各種技術進行了對缺氧微環境的無創成像。顯然，這些模式中的每一種都有自己的具體優點和缺點。相信上述問題如果得到解決，一定會在臨床上得到良好的應用。

文獻鏈接：Chemical Design and Synthesis of Functionalized Probes for Imaging and Treating Tumor Hypoxia（Chem.Rev.,2017,DOI: 10.1021/acs.chemrev.6b00525）

本文由材料人生物材料組李倫供稿，材料牛編輯整理。

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