ACS Nano文獻解讀：通過納米粒子的表面官能化和“蛋白質電暈”現象規則識別巨噬細胞

【摘要】

馬薩諸塞大學阿默斯特分校和瑞典格羅寧根大學的科學家最近在ACS Nano上發文，報道了他們在正常的生理條件下通過適當的表面工程控制“蛋白質電暈”特性及本質，蛋白質電暈特性取決于納米粒子的表面化學結構和疏水性能，通過protein corona特異性補體蛋白的識別，將納米粒子“吞進”巨噬細胞。

總之，這項研究表明表面官能化可以被用來調節形成在納米粒子表面的“蛋白質電暈”，研究具有這類納米粒子相互作用的巨噬細胞的特性。

【解讀】

蛋白質作為自然界廣泛存在且應用的大分子，不同種類的蛋白質涵蓋了生化領域的各個方面，如生物催化、手性識別、免疫和載體運輸等。近年來，多以蛋白質與納米顆粒之間相互作用即“蛋白質電暈”（Protein Corona）為題研究顆粒形貌和表面特性對蛋白活性和兩者結合能力（強度和穩定性）的影響。

這類蛋白質主要是體液存在的蛋白質，如血清白蛋白和免疫球蛋白等，研究重點在于納米顆粒進入體內后如何影響蛋白質的成分及性質。然而，根據納米顆粒與蛋白質之間的相互作用可以做成一些功能性的器件，如傳感器、藥物運輸系統和納米探針等。

納米顆粒種類的廣泛性、形貌的多樣性以及多種功能化方法的可選擇性使得蛋白質功能化納米顆粒有著巨大的應用空間，而如何改變顆粒表面性質以實現蛋白的可控負載以及如何調控兩者之間的作用關系已成為眾多科學家競相研究的熱點之一。
納米金陽離子在血液中的半衰期明顯低于在單核吞噬細胞系統器官（肝和脾等）中的壽命，無法有效的清潔血清蛋白/血漿體系。為了提高金納米顆粒在血液中的留存時間，至關重要的是弄清楚表面官能化工程對蛋白質電暈組成的影響以及被巨噬細胞的識別機制。

科學家們研究了蛋白質吸收的相互作用和巨噬細胞識別的金陽離子納米粒子表面。研究發現，NP表面的功能化影響了在生理條件下血清中的“蛋白質電暈”的形成。巨噬細胞攝取的納米粒子與吸附在納米顆粒表面的關鍵補體蛋白吸附量直接相關，這表明血液補體系統在識別納米粒子表面和隨后的吞噬都起到至關重要的作用。

重要的是，納米顆粒有相似疏水性，組成的端基是同分異構體，表明可變的冠狀蛋白質與巨噬細胞攝取在化學納米藥物設計中起到關鍵的作用。
【注：端基是指在主鏈的最尾端或者首端的基團】

【結果簡析】

圖1 研究中使用的隨著疏水性依次遞增的納米晶顆粒，Log P 代表了官能團疏水性的相對值

表1.納米顆粒的理化性質（在pH7.4時的生物體液生理環境）

研究者合成了一系列相同核心大小的金納米顆粒（2 nm核心）的不同單層官能團（圖1），探討了NP表面化學作用對蛋白質電暈形成和巨噬細胞攝取起到的作用。由于其在各種重要的傳遞相關參數的重要性，進一步選擇表面疏水性作為一個有代表性的變量，包括細胞攝取、溶血、分布和免疫應答。

最重要的是，由于具備在原子級水平上設計蛋白質的能力，研究者合成了帶有同分異構體的端基納米顆粒（例如NP5、NP6納米顆粒的端基分子式相同，但結構不同）并探討其在蛋白結合和巨噬細胞攝取方面的影響。

圖2 NP1?NP6表面結合蛋白的分類根據：（a）計算分子量；（b）計算等電點（PI）
在10%和50%的血清中，富集了所有分子量的冠狀蛋白質。相比PI＜7被吸附蛋白的主要結構與在pH值為7.4時10%和50%血清中的NP6，表明NP1-NP6與血清蛋白的結合方式主要是靜電相互作用。

研究者們也成功的對納米顆粒冠狀組成成分進行了確認和半定量分析了，其包含大約100種不同的蛋白質。（Supplementary Document S1 and S2.）中包括它們的表面結合、控制血清蛋白分子量和相對豐度等在內的數據。第一，NP1?NP6表明蛋白質尺寸與結合能力沒有明顯的關系（圖2a）。第二，在pH7.4時，蛋白質帶有凈負電荷，在血清中沒有其他相關蛋白時可以顯著富集NP1?NP6的蛋白質，表明NP1?NP6的結合主要是靜電作用。第三，在NP表面硬質蛋白的豐度與其在血清中不符，說明具有高度的NP血清選擇性作用。

圖3 在10%生理血清中NP1-NP6表面確認的分類冠狀蛋白

圖4 在50%生理血清中NP1-NP6表面確認的分類冠狀蛋白

為了更好地理解具體的化學基團在冠狀蛋白起到的作用以及后續對血液中納米顆粒的影響。根據它們在血液中的功能（即激活補體、免疫反應、凝血分類鑒定的蛋白、急性期反應和脂質代謝），進一步使用生物分析工具鑒定蛋白質并分類。在研究者的分析中，凡是培養在血清10%（圖3）和血清50%環境中（圖4）不論何種NP表面成分，發現組成冠狀蛋白的主要蛋白質類型為免疫球蛋白和載脂蛋白（約占總蛋白的60%）。

值得注意的是，在10%血清中蛋白質的數量高于50%血清中的。這大概是發生了這樣一個過程：在稀釋的血清樣品中之間的NP和血清蛋白的相互作用主要是可逆的，而在高濃度的血清蛋白，豐富的血清蛋白可以掩蓋NP表面，從而降低數量較少的那類蛋白質接觸到NP表面。

值得注意的是，載脂蛋白量隨NP表面疏水性增加而降低，印證了在10%血清中NP的疏水性是載脂蛋白形成的關鍵。然而，在蛋白質含量較高（50%血清）時并沒有觀察到脂蛋白和NP疏水量之間的相關性（圖4b）。

圖5 3h后不同生理條件下在RAW細胞中的NP1?NP6的攝入量：（a）10%血清；（b）50%血清

圖6在50%生理血清條件下NP1?NP6中巨噬細胞攝入和冠狀蛋白類型之間的關系

圖6在50%生理血清條件下NP1?NP6中巨噬細胞攝入和冠狀蛋白類型之間的關系（已選定的不同的類別的蛋白質，表現出較大的正相關或負相關）研究者進一步確定了相關的攝入方式和NP1?NP6的蛋白形成方式，促進巨噬細胞識別蛋白的形成。圖6表示為在50%血清條件下在冠狀發現某特定蛋白的皮爾森系數（r）。C4BPA和IGLC2顯示與巨噬細胞攝取最高的正、負相關系數（r）。以C4BPA為基礎組成的冠狀蛋白質將會造成更多的納米顆粒被巨噬細胞攝入，這也使得其有能力結合凋亡/壞死細胞，并為免疫清除系統識別它們。

圖7 在50%血清環境中NP1?NP6的巨噬細胞攝取和特定冠狀的關系：(a) C4BPA和 (b) IGLC2:

結果表明，親水性納米（NP1和NP2）對C4BPA具有較高的吸收（圖7a；皮爾森相關系數0.80，p值＜0.1）和巨噬細胞對上述NPs的高攝取，而疏水性納米顆粒表明低的吸收略微降低巨噬細胞的攝取能力，這表明通過適當調節NP表面疏水性以降低巨噬細胞識別能力是一個有效的途徑。

另一方面，在疏水納米顆粒表面的IGLC2具有較高吸收(圖7b，皮爾森相關系數0.82，p值＜0.05）因而降低巨噬細胞對它們的攝取，這表明通過簡單的納米顆粒表面工程可以促進或抑制特定血清蛋白對巨噬細胞的識別。總體而言，納米顆粒表面使用的類型可以通過吸附和攝入量來表征，進而通過納米顆粒表面化學的方法規則化巨噬細胞識別提供了必要的設計參數。

【總結】

在體外和生理血清不同濃度下，NP表面的功能性設計控制了冠狀蛋白質的形成。更重要的是，NP表面的冠狀蛋白不同的形成過程不僅與其表面的疏水性有關，而且也和它表面有機物端基的排列有關。并且，形成的這種蛋白質電暈進一步決定了巨噬細胞的攝取（攝取是正面或負相關某些特定類型的蛋白質，并由不同類型的NP表面的功能性表現出來），并顯示出與特定的補體蛋白具有高度相關的性質。

本研究為NP表面的工程化提供了指導性的建議，可以避免或利用關鍵蛋白成分應用于不同的治療過程。證實了血清化學設計的重要性以及為控制原位形成NP蛋白電暈提供指導。

【備注】

該研究成果近期發表在ACS Nano (IF:12.881)上，文獻鏈接：Regulation of Macrophage Recognition through the Interplay of Nanoparticle Surface Functionality and Protein Corona （非原網頁讀者請到材料牛下載）

本文由材料人生物材料學習小組guhaolove1供稿，材料牛編輯整理。

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