Nat. Commun.：利用質譜流式細胞技術對無機納米粒子在單細胞水平的生物分布進行高通量定量分析
【引言】
目前對無機納米粒子（NPs）的研究主要集中在藥物載體、放射增敏劑和成像造影劑等領域，了解無機納米粒子在生物體內的分布對評價其在上述應用中發揮的功效及安全性有著極其重要的意義。許多技術均可對無機納米粒子的生物分布進行表征，然而就目前而言，盡管這些技術中的絕大多數都可以實現對組織中無機納米粒子總積累量的測定，但由于當前人們尚未研究出延長在體內穩定標記無機納米粒子的時間的方法，僅靠現在的技術要實現在單細胞水平上跟蹤無機納米粒子是比較困難和復雜的。流式細胞術和共焦顯微鏡抗原一定程度上可在單細胞水平上追蹤無機納米粒子，但這一過程依賴于熒光，而大多數情納米粒子往往缺乏固有熒光，因此必須給它們連上合適的熒光基團。由于熒光標記降解、標記與無機納米粒子分離又或是體內行為的改變，誤差源往往被引入。由此可見，通過額外加入標記的方法追蹤無機納米粒子并在單細胞水平上對無機納米粒子進行定量是困難的、不準確的。
世界各國的研究人員開始考慮用無標記的方法對單細胞中的無機納米粒子進行定量，比較常見的方法包括電子顯微鏡、斷層掃描、激光燒蝕電感耦合等離子體質譜、單粒子電感耦合等離子體質譜等方法，但這些方法普遍存在低通量、靈敏度較低的特點。截至目前，沒有無標記的測量技術可在高通量下量化單細胞中任意尺寸的無機納米粒子。
質譜流式細胞技術是最近開發的一種結合了飛行時間電感耦合等離子體質譜與血球計數法的方法。當前Helios質譜儀可實現同時檢測單個細胞上50個金屬同位素標記，這一多參數檢測方法為復雜的生物學研究提供了便利，也使更多的研究得以有效開展。
【成果簡介】
近日，麻省理工學院Prabhani U. Atukorale和Kelly D. Moynihan（共同通訊作者）等人在Nature Communications上發表了題為“High-throughput quantitation of inorganic nanoparticle biodistribution at the single-cell level using mass cytometry”的文章，對研究團隊利用質譜流式細胞技術對無機納米粒子在單細胞水平的生物分布進行高通量定量測定的工作進行了詳細報道。該團隊的研究工作首次證明飛行時間質譜流式細胞技術可結合納米粒子校準技術為跟蹤高度多變量細胞表型的無機納米粒子提供一種無需熒光標記的方法，從而使定量分析無機納米藥物在生物體內的運動及變化成為可能。本文中還指出，質譜流式細胞技術對具有串聯多參數細胞表型的單個細胞中金納米粒子定量的方法具有較低的檢出限（核心尺寸3 nm即可被檢出）和較高的靈敏度，可對細胞內金納米粒子進行枚舉。通過觀察細胞分布，研究人員可有效選擇一種表面包覆兩親性配體的金納米粒子，這一金納米粒子可作為一種肽抗原載體靶向作用于淋巴結中樹突狀細胞，從而有效提高模型疫苗在B16-OVA黑素瘤小鼠模型中的功效。
【圖文導讀】
圖1：金納米粒子的配位化學與尺寸分布。
通過質譜流式細胞技術對單個細胞中的金納米粒子進行定量。合成三種具有不同表面化學物質的金納米顆粒——表面包覆MPSA的金納米粒子，表面包覆MUS/OT復合配體的金納米粒子以及表面包覆PEG的金納米粒子，預期這三種納米顆粒在生物體內將具有不同的生物分布。
（a）表面包覆MPSA的金納米粒、表面包覆MUS/OT復合配體的金納米粒子以及表面包覆PEG的金納米粒子示意圖；
（b）MUS/OT納米粒子的TEM圖像（比例尺10 nm）；
（c）由TEM測定的MPSA，MUS/OT與PEG納米粒子的尺寸分布。
圖2：對單個細胞中金納米粒子在寬動態范圍內的敏感檢測。
將RAW巨噬細胞在100、10、1、0.1、0.01 μg ml－1 BODIPY標記的MUS/OT金納米粒子中培養，或將其在37℃環境下單獨放置6小時，洗滌3次，然后通過質譜流式細胞技術或流式細胞技術進行分析（每組3個樣本）。
（a）由5個不同濃度處理過的細胞中檢測到的金納米粒子數目繪制得到的直方圖；
（b）通過流式細胞技術（每組3個樣品）評估5種不同濃度處理的細胞的熒光強度中位數；
（c）通過質譜流式細胞技術對五種不同處理濃度下每個細胞中的金納米粒子數量的定量分析以及通過電感耦合等離子體原子發射光譜對細胞中金納米粒子大量測定分析的結果比較（每組3個樣品）。
圖3：通過質譜流式細胞技術檢測所有肺細胞中的金納米粒子數目。
通過氣管內給藥的方法使BODIPY-MUS/OT 金納米粒子（50 mg 于PBS中）或鹽水進入C57B1/6小鼠體內（每組4個樣品，從兩個單獨的實驗匯集）。給藥兩小時后，取肺組織并用標記抗體染色，然后通過質譜流式細胞技術或流式細胞技術進行分析。
（a）將與金屬（165Ho）螯合的或用FITC標記的CD326抗體與肺細胞一起進行染色，同時用質譜流式細胞技術和流式細胞技術進行分析；
（b）通過質譜流式細胞技術檢測為AuNP陽性的上皮細胞與非上皮細胞的平均百分數；
（c）采用質譜流式細胞技術方法對500萬個被定義為CD326-BODIPY-的細胞進行分選，并用電感耦合等離子體原子發射光譜對每個細胞中的金納米粒子進行定量；
（d）通過質譜流式細胞技術方法直接測定單個細胞中的金納米粒子數；
（e-k）通過肺氣管往肺中注入1 μg MUS/OT 金納米粒子24小時后,將細胞分離出來，通過典型的質譜流式細胞技術方法進行分析；
（l）B細胞（CD45+ B220+ CD3-）、T細胞（CD45+ B220- CD3+）、樹突狀細胞（DCs，CD45+ CD11chiCD11b+ CD64-）和肺泡巨噬細胞（AMs，CD45+ CD11chi CD11b+ CD64+）中黃金強度直方圖。
圖4：樹突狀細胞攝取以及與有效疫苗應答相關的MUS/OT金納米粒子。
（a）將300 mg MUS/OT或PEG金納米顆粒分別注射到C57B1/6小鼠（每組5只小鼠）體內，24小時后通過電感耦合等離子體原子發射光譜對在腰、腹股溝、腋窩中淋巴結的總金納米顆粒數進行定量分析；
（b，c）將300 mg MUS/OT、MPSA或PEG金納米顆粒分別注射到C57B1/6小鼠（每組小鼠數n≥3）體內，24小時后切除淋巴結并對其進行染色和分析。用Au的直方圖顯示不同白細胞群體中金納米顆粒的水平（b）以及淋巴結細胞群體平均每個細胞中的納米顆粒數量（c）；
（d）SIINFEKL肽結構及其與MUS/OT納米顆粒表面耦合的示意圖；
（e-i）將8 mg CpG和與MUS/OT（10 mg 肽）、50 mg SIINFEKL 肽、10 mg SIINFEKL 肽或10 mg SIINFEKL 肽結構結合的SIINFEKL混合,通過皮下注射的方法一并注入到C57B1/6小鼠體內（每組小鼠數n≥5）后第1天與第14天的免疫狀況。
【小結】
目前來說，從組織和細胞水平上表征生物體內的新型納米藥物的困難限制了無機納米顆粒在生物醫學領域的廣闊應用。基于熒光標記的方法，前人已基本實現了在單細胞水平上跟蹤納米材料的生物分布。然而，對于本質上不發生熒光的納米材料，實現染料與體內顆粒穩定結合仍是一個重大挑戰。表面官能化標記物可能會使納米材料降解或解離，從而降低生物分布結果的強度、可靠性和準確性。直接檢測納米顆粒核心原子的方法可有效克服上述問題。本研究中，研究人員證明了質譜流式細胞技術的方法可用于同時對數千個單細胞中的納米粒子進行定量測量。檢測體外培養細胞內的金納米顆粒時，質譜流式細胞技術比熒光標記/流式細胞儀的靈敏度高2400倍；而在體內，該方法提供了更為敏感的納米顆粒檢測條件，可有效完成由于組織自發熒光或染料損失導致的傳統基于熒光對納米顆粒進行跟蹤的方法所無法完成的跟蹤任務。在本文中，研究人員將質譜流式細胞技術與電感耦合等離子體原子發射光譜結合，分析了三種具有不同表面有機配體的金納米粒子的生物分布，證明了金納米顆粒的表面化學性質對金納米顆粒在組織和細胞水平的生物分布有顯著影響。他們發現，amph-納米粒子能夠大大改善肽疫苗的應答，并有效地防止腫瘤的生長。本文還證明，使用質譜流式細胞技術能夠快速、準確、高靈敏度地篩選無機納米粒子從而實現高通量定量分析。總之，飛行時間單細胞質譜流式細胞技術能夠實現對與高度多元表型結合的無機納米粒子生物分布的高靈敏檢測，這種跟蹤不同無機納米材料生物分布的能力將有助于人們了解納米材料毒理學，并對納米材料新的診斷和治療方法的發展帶來契機。
文獻鏈接：High-throughput quantitation of inorganic nanoparticle biodistribution at the single-cell level using mass cytometry（Nat.Commun., ?2017, DOI: 10.1038/ncomms14069）
本文由材料人編輯部新人組雪琰供稿，材料牛編輯整理。
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