俄亥俄州立大學Nature Nanotechnology：通過納米粒子方向性控制RNA及相應配體達到治療癌癥的效果

【引言】

納米材料是80年代中期發展起來的新型材料。納米材料具有許多獨特功能，而且用量少，但卻賦予材料意想不到的高性能，附加值甚高。納米復合高分子材料、納米抗菌、保鮮、除臭材料等等，由于納米材料的尺寸小，比血液中的紅血球小一千多倍，比細菌小幾十倍，氣體通過其擴散的速度比常規材料快幾千倍。納米顆粒與生物細胞膜的化物作用很強，極易進入細胞內。此篇文章報道了納米技術對RNA方向控制的優勢。

【成果簡介】

近日，俄亥俄州立大學的美國NIH納米醫學中心主任郭培宣教授（通訊作者）等人在Nature Nanotechnology上發表最新研究成果“Nanoparticle orientation to control RNA loading and ligand display on extracellular vesicles for cancer regression”。在該文中，研究團隊報道了應用納米技術來控制RNA方向的優勢性。實驗通過改變箭頭狀RNA的方向來控制細胞外囊泡膜上的配體，或調控干擾小RNA、微RNA的細胞內運輸。在箭頭狀RNA的尾部放置膜錨定膽固醇使細胞外囊泡的外表面上出現RNA適體或葉酸。利用具有特定靶向的RNA配體與細胞外囊泡進行有效融合，由此得到的配體能夠將siRNA精準遞送至細胞，并有效地阻斷三種癌癥模型中的腫瘤生長。

【圖文導讀】

圖1 修飾原生細胞外囊泡的RNA納米技術?

a) 噬菌體phi29的擴展三通連接馬達pRNA的原子力顯微鏡圖像，色標表示幅度變化；

b) 3WJ箭頭或箭頭狀膽固醇標記位置示意圖；

c) 通過差速超速離心（UC）方法和緩沖墊修飾超速離心法純化的HEK293T細胞的細胞外囊泡的負染電子顯微鏡（EM）圖像；

d-g) 用納米粒子跟蹤分析方法進行的尺寸分析示意圖和用于zeta電位測量的動態光散射示意圖；

h) 二維結構（左圖）和原生PAGE，用于從三個組分鏈組裝的3WJ 示意圖；

i) 細胞外囊泡負載與RNA適體的示意圖。

圖2 箭頭狀RNA和箭頭狀3WJ的作用比較?

a,b) 箭頭狀細胞外囊泡和箭頭狀3WJ的區別示意圖；

c,d) 箭頭狀和箭頭狀Alexa647-3WJ/EV在牛胎血清中核糖核酸酶的降解情況，凝膠在Alexa647的通道上成像，凝膠成像（c）產生的條帶通過圖像（d）定量表示；

e-i) 比較受體陽性和陰性細胞中箭頭狀葉酸-3WJ的細胞結合能力；

e-g) 比較受體陽性和陰性細胞中箭頭狀細胞外囊泡的細胞結合能力；

h,i) 比較受體陽性和陰性細胞中葉酸的細胞結合能力。* p <0.05。

圖3 含PSMA適體的細胞外囊泡在體外進行特異性結合與siRNA的遞送?

a) PSMA RNA適體的細胞外囊泡與PSMA受體陽性和陰性細胞結合的流式細胞術（左）和共焦圖像（右）。共聚焦圖像中的核（藍色），細胞骨架（綠色），RNA（紅色）；

b) 通過細胞外囊泡向PSMA+前列腺癌細胞的PSMA-適體介導遞送生存素siRNA的RT-PCR測定。統計：n=4；實驗用四個生物學重復和二到四個技術重復進行ANOVA分析；校正：p=0.0120,0.0067，分別比較PSMAapt/EV/siSurvivin和PSMAapt/EV/siScramble和3WJ/EV/siSurvivin；

c) 對減少的細胞進行MTT測定。n=3，p=0.003,0.031，分別比較PSMAapt/EV/siSurvivin與PSMAapt/EV/siScramble和3WJ/EV/siSurvivin。* p <0.05，** p <0.01。

圖4 使用含配體的細胞外囊泡抑制腫瘤生長?

a) 器官圖像顯示在將皮下細胞外囊泡的全身性葉酸注射到具有皮下KB細胞異種移植物的小鼠8小時后的特異性腫瘤靶向。n=2，兩個獨立的實驗；

b) 用靜脈內處理攜帶皮下LNCaP-LN3且異種移植PSMAapt/EV/siSurvivin或PSMAapt/EV/siScramble（均具有0.6mg/kg，siRNA/小鼠體重）的裸鼠，以注射PBS為對照，每周注射兩次，注射三個星期。生物學重復n=10，兩個獨立的實驗，并且統計數據使用以平均值和標準偏差表示的雙側t-檢驗來計算。第15,18天的p=0.347,0.6×10-2,1.5×10-6,8.2×10-8,2.1×10-7,1.0×10-7,1.9×10-7和1.8×10-6，22,25,29,32,36和39分別表示PSMAapt/EV/siSurvivin和對照組；

c) 用細胞外囊泡治療期間小鼠的體重；

d) 用細胞外囊泡治療后前列腺腫瘤中降低存活蛋白mRNA表達的趨勢。

圖5 乳腺癌原位異種移植小鼠模型中表皮生長因子受體適體可以提供生存素siRNA?

a) 有EGFR適體的細胞外囊泡對原位異種移植小鼠模型中乳腺腫瘤有增強的靶向作用。色標表示“方法”中定義的輻射效率；

b) 用EGFRapt/EV/siSurvivin和對照FBS（n=5）靜脈內處理攜帶乳腺癌原位異種移植物的裸鼠。6周后，EGFRapt/EV/siSurvivin治療組腫瘤大小明顯小于其他對照組。將EGFRapt/EV/siSurvivin與EGFRapt/EV/siScramble進行比較，p=0.008；

c) 腫瘤提取物中蛋白質表達的分析顯示EGFRapt/EV/siSurvivin處理顯著降低了存活蛋白的表達。將EGFRapt/EV/siSurvivin與EGFRapt/EV/siScramble進行比較，p=0.0004；

d) 將從腫瘤中提取的RNA進行定量實時PCR測定，與對照相比，EGFRapt/EV/siSurvivin處理的小鼠中的存活蛋白mRNA減少。比較EGFRapt/EV/siSurvivin與EGFRapt/EV/siScramble，其中p=0.024。錯誤條表明s.e.m.*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；

圖6 含葉酸的細胞外囊泡將生存素siRNA遞送至患者衍生的結直腸癌異種移植物（PDX-CRC）的小鼠模型?

a) 用FA/EV/siSurvivin和對照FBS靜脈內治療攜帶PDX-CRC異種移植物的裸鼠（n=4）。6周后，相比于4周和5周時，FA/EV/siSurvivin治療組的腫瘤顯著縮小，FA/EV/siSurvivin和FA/EV/siScramble分別為p=0.0098和p=0.0387；

b) 治療組與對照的腫瘤質量比較。比較FA/EV/siSurvivin與FA/EV/siScramble，p=0.0024。錯誤條表示s.e.m.*p<0.05，**p<0.01。

【小結】

這項研究使用RNA納米技術對原生細胞外囊泡進行有效的重新編程。使用RNA納米顆粒的方向來控制細胞外囊泡上的siRNA和miRNA的負載或在細胞外囊泡的表面實現有效的細胞靶向性，以及控制siRNA和miRNA的遞送，且對癌癥退化產生作用。在三種動物模型中，經過重新編程的細胞外囊泡表現出強大的生理化學性質，癌細胞特異性靶向性增強，且能有效釋放細胞內siRNA以抑制腫瘤生長。

文章鏈接：Nanoparticle orientation to control RNA loading and ligand display on extracellular vesicles for cancer regression（Nature Nanotechnology，2017，DOI：10.1038/s41565-017-0012-z）

本文由材料人編輯部生物材料學術組昝菲供稿，材料牛編輯整理。

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