Adv. Funct. Mater.封面：腫瘤特異性自降解納米凝膠作為抗腫瘤蛋白系統遞送的潛在載體

【引言】

過去幾十年來，隨著蛋白質組學和蛋白質工程等新興領域的發展，蛋白藥物在數量和種類上都在不斷增長。蛋白質藥物具有活性高、特異性強和毒性低的優點，可以有效治療許多疾病，如肝炎、糖尿病和癌癥。然而，穩定性差、生物利用度低、生物膜通透性差和免疫原性等缺點大大限制了蛋白質藥物的開發。納米載體（包括脂質體和聚合物納米粒子）的應用，為提高蛋白藥物的穩定性、生物利用度以及降低免疫原性提供了一種有效的策略。納米凝膠具有高容水量，可調節的物理化學性質和良好的生物相容性。其納米尺寸（100-200 nm）適用于血液中的長循環，并可優先靶向目標作用部位，如腫瘤組織。這些特性使納米凝膠成為蛋白質遞送應用和納米醫學用于癌癥治療的有利候選者。

【成果簡介】

近日，中國藥科大學莫然教授（通訊作者）等人報道了腫瘤特異性自降解納米凝膠用于用于靜脈給藥蛋白藥物的高效遞送。該納米凝膠以合成的膽固醇和丙烯酰胺雙修飾透明質酸衍生物（cm-HA）為載體材料，利用膽固醇疏水作用力物理交聯，結合光引發丙烯酰胺化學交聯，協同組裝形成納米凝膠（cNG）。該納米凝膠對不同分子量和等電點的蛋白均有高負載效率，并具有高穩定性。為了增強納米凝膠的腫瘤組織滲透性，并達到腫瘤細胞內蛋白藥物的可控釋放及載體完成遞送任務后的及時降解的目標，在納米凝膠中引入了酸激活的透明質酸酶（aHAase），構建了腫瘤微環境響應性自降解納米凝膠（D/aH-cNG）。在腫瘤微環境中，弱酸激活部分aHAase，引起cNG漲大并釋放活化的HAase。釋放HAase可以降解腫瘤細胞外基質的主要成分HA，從而促進 cNG在腫瘤基質中的擴散。被腫瘤細胞攝取進入酸性內吞囊泡后，aHAase被完全激活。活性HAase完全降解cNG，釋放包載的蛋白脫氧核糖核酸酶I（DNase I），后者會降解DNA引起腫瘤細胞死亡，從而發揮腫瘤效力。該成果以“Tumor-Specific Self-Degradable Nanogels as Potential Carriers for Systemic Delivery of Anticancer Proteins”為題于2018年2月19日發表在期刊Advanced Functional Materials上。

【圖文導讀】

圖1. 腫瘤特異性自降解D/aH-cNG用于靜脈給藥蛋白藥物的高效遞送的示意圖

a）協同交聯的D/aH-cNG的組裝和腫瘤特異性自降解的示意圖；

b）D/aH-cNG對提高抗腫瘤蛋白藥物遞送能力的示意圖。（i）D/aH-cNG在腫瘤組織部位蓄積; （ii）腫瘤弱酸性微環境部分激活aHAase，其導致D/aH-cNG的漲大和活性HAase的細胞外釋放，釋放的HAase降解HA組成ECM以增強納米凝膠在基質中的擴散；（iii）D / aH-cNG滲透到深部腫瘤區域；（iv）D/aH-cNG被腫瘤細胞內吞;（v）內吞小泡中的酸性環境完全激活HAase，導致cNG的完全降解和細胞內DNase I的快速釋放；（vi）釋放的DNase I降解DNA引起腫瘤細胞死亡。

圖2. 穩定性考察

a）由不同膽固醇己二胺與HA羧基（Chol：COOH）投料比合成得cm-HA自組裝得到的pNG的粒徑和多分散系數（PDI）；

b）與HP-β-CD共孵的cNG和pNG隨時間的粒徑變化；

c）Rho-D-pNG與HP-β-CD共孵前后的Rho-D釋放曲線；

d）Rho-D-pNG和Rho-D-cNG與FBS共孵后的Rho-D釋放曲線。

圖3. 納米凝膠的表征

a）D/aH-cNG的粒徑分布直方圖和TEM圖像（比例尺：100 nm）；

b）在不同pH值下，D/aH-cNG隨時間的大小變化；

c）在不同pH值下，Rho-D/aH-cNG中Rho-D的釋放曲線；

d）在不同pH值下，用D/aH-cNG和D-cNG與DNA底物共孵，吸光度在260nm處隨時間的變化曲線。

圖4. 細胞攝取、胞內轉運與釋放

a)A549細胞在用HA預處理后與Rho-D/aH-cNG共孵1小時后的共聚焦顯微鏡圖像（Alexa Fluor 488染細胞膜）；

b)A549細胞在不同情況下與Rho-D/aH-cNG共孵1小時后的相對熒光強度（RFI）；

c)A549細胞與Rho-D/aH-cNG共孵0.5小時和4小時后的共聚焦顯微鏡圖像（Lyso Tracker Green染溶酶體，Hoechst染細胞核）；

d)A549細胞與Rho-D/FITC-D/aH-cNG共孵1小時和6小時后的共聚焦顯微鏡圖像(Hoeshst染細胞核)。黃色箭頭指出了Rho-D與FITC-D重疊的點。紅色箭頭和綠色箭頭分別指出了Rho-D和FITC-D（比例尺為10 μm）。

圖5. 組織分布和腫瘤滲透性

a）荷瘤小鼠經靜脈注射Cy5.5-D/aH-cNG（i）和游離Cy5.5-D（ii）后3小時和24小時的圖像。紅色箭頭指向為腫瘤區域；

b）靜脈注射24小時后從小鼠上收集的不同組織的圖像。從1到6分別為心臟，肝臟，脾臟，肺臟，腎臟和腫瘤；

c）通過ROI分析不同組織的平均熒光強度。從1到6分別為心臟，肝臟，脾臟，肺臟，腎臟和腫瘤；

d）荷瘤小鼠經靜脈注射Rho-D/aH-cNG和Rho-D-cNG后24小時的腫瘤組織的共聚焦顯微鏡圖像（比例尺為100 μm）。

圖6. 體內外抗腫瘤活性評價

a）用不同制劑處理后的A549細胞的活力;

b）用D-aH/cNG處理后通過TUNEL測定法染色的A549細胞的熒光圖像（比例尺為20 μm）；

c）用不同制劑處理后，荷瘤小鼠的腫瘤大小變化，* p <0.05；

d）不同制劑首次給藥30天后的腫瘤重量， * p <0.05，** p <0.01；

e）不同制劑首次給藥30天后，用H＆E染色的腫瘤圖像（比例尺為100 μm）；

f）不同制劑首次給藥30天后，用Ki-67抗體染色的腫瘤圖像（比例尺為100 μm）。

【小結】

總之，該研究設計了一種腫瘤特異性酸響應的自降解納米凝膠，用于高效的蛋白質輸送和癌癥治療。基于HA的協同交聯的納米凝膠具有內部水合網絡結構，對于不同分子量（MW）和等電點（pI）的蛋白質均具有高負載能力，而且具有良好的血漿穩定性。納米凝膠中引入酸活化的aHAase，可實現有效的級聯蛋白遞送：腫瘤組織的深層滲透、細胞攝取的增加、細胞內蛋白質的可控釋放和載體材料的有效降解。這一策略將促進具有程序性自驅動降解性的納米載體的開發，為蛋白藥物的遞送和腫瘤治療提供新技術和新手段。

文獻鏈接：Tumor-Specific Self-Degradable Nanogels as Potential Carriers for Systemic Delivery of Anticancer Proteins(Adv. Funct. Mater.,2018,DOI: 10.1002/adfm.201707371)

通訊作者簡介：莫然，中國藥科大學教授，博導，主要從事新型藥用功能材料及其構建的智能遞藥系統的創新研發，特別致力于抗腫瘤藥物的精準遞送，用于惡性腫瘤的高效治療。以通訊或第一作者在Nature Nanotechnol.、Nature Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Mater.、Nano Lett.、Adv. Funct. Mater.等國際期刊上發表SCI論文25篇，其中影響因子>30的論文2篇，30>影響因子>10的論文11篇，他引1000余次，入選ESI高被引論文3篇。研究成果被Nature、Nature Reviews Cancer、Nature Reviews Drug Discovery、F1000 Prime等國際期刊和新聞媒體亮點報道。曾獲中國藥學會以嶺生物醫藥青年獎、中國藥學會青年藥劑學獎。

感謝本文通訊作者中國藥科大學莫然教授對本文的斧正！

本文由材料人編輯部生物材料組Meadow供稿，材料牛整理編輯。

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