中科院上硅所施劍林Adv. Mat.：Fe-Au納米粒子耦合體系用于循環腫瘤DNA的高靈敏度檢測

【引言】??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????

實現癌癥的早期診斷并及時治療是提高癌癥治愈率最有效的策略。研究人員在癌癥患者的外周血中檢測到與腫瘤細胞一致的突變基因，即循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）。ctDNA 是由腫瘤細胞釋放到血液循環系統中的基因碎片，是癌癥散落在血液中的“信息密碼”。 ctDNA濃度的變化要遠早于影像學等手段檢測到腫瘤組織的變化。與傳統的影像學診斷、內窺鏡檢查以及病理學診斷相比，對ctDNA的精準分析能實時監測病人體內腫瘤負荷的動態信息，可更加敏感地發現疾病的變化，更加科學、迅速的評價某一治療方案的效果，優勢顯著。最為重要的是，對ctDNA的監測只需要抽取患者少量外周血，對患者沒有副作用，可實現多次實時高頻監測。ctDNA 檢測是一種新型無創的“液體活檢”方式，有望彌補現有臨床診斷方法的不足，提供從腫瘤細胞水平到分子水平的分析平臺，為個體化治療提供參考。基于ctDNA檢測的無創“液體活檢”技術有望取代侵入性的“組織活檢”用于腫瘤治療進展的監測，該領域的基礎研究具有非常重要的科學意義和臨床價值。然而現有的基于聚合酶鏈式反應（PCR）和基因測序（NGS）的ctDNA檢測技術預處理步驟繁瑣，假陽性幾率高, 特異性和靈敏度受限，現階段無法作為常規的診斷方法應用于臨床醫學中。

【成果簡介】

近日，中國科學院上海硅酸鹽研究所的施劍林教授（通訊作者）團隊基于當前ctDNA 檢測面臨的技術難點，提出一種基于兩種功能性納米粒子特異性耦合、結合磁性分離富集，實現循環腫瘤DNA 高靈敏度精準檢測的新方法。通過兩種納米顆粒表面修飾的捕捉DNA與目標ctDNA互補配對，保證了識別的高度專一性；制備了高磁導率、快速磁響應的非晶鐵@SiO₂納米顆粒對ctDNA進行高效磁性分離與富集，避免了繁瑣的PCR擴增與基因測序過程，克服了ctDNA因低濃度無法檢測的難題，實現了ctDNA的快速、特異、高靈敏度檢測，有望推動基于ctDNA檢測的液體活檢技術在腫瘤診療中的應用。相關成果以題為“Fe-Au Nanoparticle-Coupling for Ultrasensitive Detections of Circulating Tumor DNA”發表在Adv. Mat.雜志上，論文的共同第一作者為胡萍、張盛箭。

?【圖文導讀】

圖1.檢測突變KRAS基因的納米顆粒耦合策略

以突變的KRAS 基因作為檢測的目標ctDNA。如圖所示，首先將突變KRAS 基因的互補堿基序列分為兩段引物DNA₁和DNA₂ 制備， 然后在非晶Fe@SiO₂ 磁性納米顆粒表面修飾DNA₁， Au 顆粒表面修飾DNA₂; 當突變的KRAS 基因存在時, 納米顆粒表面修飾的引物鏈（DNA₁和DNA₂）與突變的KRAS 基因互補配對，非晶Fe@SiO₂ 納米顆粒和Au 納米顆粒通過突變的KRAS 基因偶聯在一起。磁性分離出的非晶Fe@SiO₂ 表面有Au 納米顆粒說明檢測體系中存在突變的KRAS 基因; 無目標待測基因存在時，磁性分離得到的非晶Fe@SiO₂ 表面無Au 納米顆粒。通過電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）檢測磁性分離產物中Au 元素的含量，根據標準溶液中Au 含量與突變的KRAS 基因含量的線性關系，實現對ctDNA 的準確定量。

圖2.納米顆粒探針的表征

a）AFe納米粒子的低倍TEM照片（插圖為AFe的選區電子衍射）；

b）AFe納米粒子的高倍TEM照片；

c）EDS能譜分析揭示了納米顆粒中的主要元素;

d）AFe@SiO₂ 納米顆粒的TEM照片；

e）AFe@SiO₂納米顆粒在磁鐵吸引下聚集的照片；

f）利用ICP-MS檢測水溶液中AFe@SiO₂納米顆粒的磁分離效率，在2.5分鐘內磁性分離率為75.8％，并在15分鐘內達到100％（即完全分離）；

g-h） Au納米顆粒的低倍TEM照片和高倍TEM照片；

i） Au納米顆粒表面修飾捕捉DNA₂前后的UV-Vis吸收光譜變化（AuNPs: black line，Au-DNA₂ NPs: red line ）

圖3.納米探針對突變KRAS基因檢測的靈敏度和選擇性評估

a-d） 不同濃度a）0.3ng mL^-1, b) 0.12 ng mL^-1, c) 0.06 ng mL^-1, d) 0 ng mL^-1 的突變KRAS基因（134A序列）存在時AFS-D和A-D納米顆粒耦合體系的TEM照片；

e）Au元素的濃度（pg mL^-1）與系統中134A序列濃度之間的線性關系證明該檢測方法具有較高的靈敏度；

f）AFS-D和A-D納米探針對于檢測突變KRAS基因的七種等位基因的有效性；

g）在NRAS等其他癌基因存在時，AFS-D和A-D納米探針對目標突變KRAS基因的檢測沒有受到影響，證明該檢測方法具有很好的選擇性 。

圖4.納米顆粒耦合體系針對實際血液樣本的具體檢測方案

（1）在95^oC下ctDNA雙鏈解鏈成單鏈DNA；（2） 加入“磁性納米鉗”顆粒，使其與突變型KRAS序列的互補鏈(C-MT-KRAS) 和野生型KRAS序列的互補鏈(C-WT-KRAS) 發生堿基互補配對，從而防止目標待測的突變KRAS序列(MT-KRAS)與互補鏈再雜交；（3）檢測系統降低到0^oC；（4）加入表面修飾“掩蔽DNA”的磁性納米粒子，使其與野生型KRAS序列(WT-KRAS)互補配對，完全掩蔽野生型KRAS序列對檢測的干擾；（5）通過磁分離完全去除檢測體系中的C-WT-KRAS、C-MT-KRAS和WT-KRAS；（6）加入AFe@SiO₂-DNA₁和Au-DNA₂納米探針進行突變KRAS基因的高靈敏度、無干擾檢測。

圖5.“磁性納米鉗”與“磁性掩蔽劑”對于高靈敏檢測的重要性

a）“磁性納米鉗”與“磁性掩蔽劑”在檢測中發揮重要的作用：添加“磁性納米鉗”（A）可以避免目標基因漏檢, “磁性掩蔽劑”（B）可以降低檢測的假陽性概率；b) 對于U87等六種惡性腫瘤細胞DNA中突變KRAS序列的檢測結果。

表1.臨床肺腺癌患者血液樣本中突變KRAS基因的檢測結果

圖6.納米粒子耦合體系對于荷瘤小鼠血液中突變KRAS基因的動態跟蹤檢測

a）對于未實施治療的荷瘤裸鼠血液中突變KRAS基因的動態檢測結果：荷瘤裸鼠血液中突變KRAS基因的濃度隨著腫瘤負荷的增加而持續增加；

b）對于化療后荷瘤裸鼠血液中突變KRAS基因濃度的動態檢測結果：化療后短時間內突變KRAS基因濃度下降，7天后突變KRAS基因濃度又開始回升；

c）對于癌癥早期實施手術切除腫瘤后，血液中突變KRAS基因濃度迅速下降，手術后42天內血液中未檢測到突變KRAS基因；

d）對于癌癥晚期實施手術切除腫瘤后，血液中突變KRAS基因濃度迅速下降，手術后21天檢測到突變KRAS基因濃度又開始回升。

【小結】

本工作合成了具有高效磁響應性能、生物相容性好的AFe@SiO₂ 納米復合材料，構建了基于兩種功能型納米探針的耦合體系用于循環腫瘤DNA的特異、高靈敏度識別，克服了現有的ctDNA 檢測技術面臨的濃度低、背景干擾嚴重兩大難題，發展了一種全新的基于納米生物技術的ctDNA檢測策略。最重要的是該方法能成功檢測出Ⅰ期肺腺癌患者血清樣本中低至0.27 pg mL^-1的突變KRAS基因，顯示出很好的臨床應用前景。AFe@SiO₂ 與Au 納米耦合體系將納米材料獨特的物理和化學性能應用于基于ctDNA 檢測的液體活檢領域，可能為臨床腫瘤的早期診斷、預后判斷及跟蹤隨訪提供一系列方便、快捷、特異、無創的檢測手段。

文獻鏈接：Fe–Au Nanoparticle-Coupling for Ultrasensitive Detections of Circulating Tumor DNA（Adv. Mat.，2018，DOI: 10.1002/adma.201801690）

?【通訊作者及團隊簡介】

施劍林教授，曾從事先進陶瓷材料制備科學、燒結理論、結構陶瓷高溫可靠性等研究。當前的研究領域包括無機納米材料、介孔基納米復合材料合成與催化、抗癌藥物靶向輸運、腫瘤等重大疾病的早期診斷與治療等研究。先后承擔了國家重大基礎研究（“973”）計劃(首席科學家)，國家高技術（“863”）項目、國家自然科學基金重點項目、發改委高技術產業化項目等重要研究課題。

以（共同）通訊/第一作者發表SCI論文465篇，他人引用25000余次，H-index為89。入選湯森-路透2015-2017年全球高被引作者。出版專著《現代無機非金屬材料工藝學》、《先進陶瓷物理化學原理與技術》、《無機光學透明材料--透明陶瓷》三本。 以第一完成人獲國家自然科學二等獎一項（2011年度）、上海市自然科學一等獎兩項（2008，2014）和上海市科技進步一等獎（2009）一項等科技獎勵。 另獲兩院院士評選中國十大科技進展（2005）、中國青年科技獎、中科院青年科學家獎、上海市自然科學牡丹獎、上海市科技精英等獎勵。

本文由材料人編輯部魏巧琳編譯，點我加入材料人編輯部。

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