清華王宏偉、陳亞楠&北大彭海琳JACS：生物活性功能化石墨烯助力高分辨冷凍電鏡

近年來，冷凍電子顯微鏡技術得益于硬件和軟件的技術革新，發展迅猛，已經成為結構生物學領域中不可或缺的技術手段。然而冷凍電鏡技術仍然面臨著一些瓶頸，嚴重限制了該技術解析生物分子結構的效率。其中一個重要瓶頸是冷凍樣品的制備。該過程需要將含有生物大分子的溶液加到電鏡載網上，然后迅速冷凍到液態乙烷中，將生物大分子瞬間冷凍在一層大約幾十納米厚的玻璃態冰層中。目前通用的樣品制備支撐膜容易導致生物大分子吸附到氣液界面，從而發生分子結構的變性或者優勢取向等問題，造成高分辨率結構解析的困難。

近日，來自清華大學生命學院的王宏偉教授（通訊作者）， 高精尖中心卓越學者陳亞楠博士（通訊作者），劉楠博士生（第一作者）與北京大學化學分子工程學院的彭海琳教授（通訊作者），張金燦博士生（共同一作）合作在《Journal of the American Chemical Society》（JACS）上發表題為“Bioactive functionalized monolayer graphene for high resolution cryo-EM”的研究論文。作者設計開發了一種新型功能化石墨烯電鏡支撐膜用于冷凍電鏡高分辨率三維結構解析。石墨烯具有高強度韌度、單原子層薄、強導電導熱性等優異特質，是一種理想的電鏡樣品支撐膜。作者將CVD生長的大單晶石墨烯（面積超過10mm²）利用無膠轉移法轉移到電鏡金屬載網上，并經過高錳酸鉀等強氧化劑處理，活化石墨烯支撐膜表面，然后共價修飾上Ni-NTA等生物學科研中常用的蛋白純化配體。這種功能化石墨烯支撐膜具有高親水性（親水角達到29°）。經過拉曼光譜和電子衍射等表征發現，化學修飾過程對單晶石墨烯的晶體結構、抗電子輻照損傷能力等影響不大，極大地保持了石墨烯原有的優異特質。在熒光顯微鏡和負染電鏡下，Ni-NTA修飾的石墨烯對帶有His標簽的紅色熒光蛋白（RFP）和核苷酸磷酸化酶（PNPase）展現了極強的親和力，能夠特異性地將目標蛋白捕獲。作者進一步驗證了功能化石墨烯對目標蛋白的選擇性，發現這種Ni-NTA修飾的支撐膜能夠從蛋白酶體和核糖體的混合溶液中，選擇性地抓取帶有His標簽的蛋白酶體，而對不含His標簽的核糖體起到一定程度上的過濾作用。冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）表明，目標蛋白(蛋白酶體)能夠緊緊結合在生物活性配體修飾的石墨烯表面，遠離氣液界面，從而避免了蛋白變性等傳統冷凍樣品制備方法中常見問題。作者利用功能化石墨烯支撐膜制備冷凍樣品，在Thermo Fisher Tecnai Arctica電子顯微鏡 (200 keV，配備Falcon II直接電子探測相機)上收集了冷凍電鏡數據，并成功解析獲得了蛋白酶體的近原子分辨率（3.8埃）的三維重構。

【圖文導讀】

圖1：生物活性配體功能化修飾石墨烯用于冷凍電鏡高分辨結構解析流程示意圖。

圖2: 大單晶石墨烯電鏡載網Ni-NTA配體化學修飾表征。

圖3: 功能化修飾后的石墨烯具有高親水性，并且基本保持了石墨烯原有的晶格結構和抗輻照損傷的特性。

圖4: 功能化修飾的石墨烯支撐膜對目標蛋白質分子具有強特異親和性。

圖5: 功能化石墨烯對目標蛋白具有選擇結合性。

圖6: 功能化石墨烯能夠將目標蛋白錨定在支撐膜表面，有助于獲得近原子分辨率的冷凍電鏡三維重構。

作者開發了一種新型的具備生物活性功能化的大單晶石墨烯電鏡支撐膜，可以有效地避免生物樣品接觸氣液界面等限制冷凍電鏡結構解析的問題，并且實現選擇性地結合目標分子，有望簡化生物樣品冷凍電鏡樣品制備的流程。作者所使用的化學修飾方法極大地保持了石墨烯的高導電/熱、高強度、電鏡成像低噪音的性質。作者展望，功能化石墨烯支撐膜能夠給高分辨率冷凍電鏡結構解析提供具備更高效率和較高重復率的樣品制備方法，并且將在冷凍電子斷層掃描以及單分子成像等領域有潛在的應用前景。

該項目獲得科技部、國家自然科學基金委、北京市科委等的經費支持。

文獻鏈接：Bioactive functionalized monolayer graphene for high resolution cryo-EM.（JACS，2019，DOI：10.1021/jacs.8b13038）

投稿以及內容合作可加編輯微信：cailiaorenvip。

歡迎大家到材料人宣傳科技成果并對文獻進行深入解讀，投稿郵箱tougao@cailiaoren.com。