南開大學楊志謀團隊 Adv. Mater.綜述: 多肽的酶促自組裝(EISA)和凝膠化

【背景介紹】

眾所周知，自組裝是生物系統中普遍存在的一種現象，其主要是通過非共價相互作用使無序的單個分子自發形成有序的超分子結構的過程。因此，自組裝可以使超分子納米材料具有多種功能，是一種制造復雜生物材料的通用平臺，在生物醫學和生物材料領域有很大的應用價值。超分子材料的性質與其分子構筑單元和制備方法密切相關。在眾多的構筑單元中，短肽由于具有良好的生物活性和生物相容性而具備很強的發展潛力短肽本身具有低穩定性和在體內易被酶降解的缺點，阻礙了其進一步轉化為藥物或診斷工具。短肽自組裝成的超分子材料，能夠延長其體內半衰期和提高其生物活性。因此，自組裝多肽不僅在藥物遞送材料、免疫佐劑和組織工程支架等領域有巨大的應用前景，同時，對其組裝行為的研究有助于我們理解生命系統中的天然自組裝結構或疾病相關的蛋白異常組裝行為。

目前已經有許多策略來觸發肽的自組裝和形成超分子材料，例如溫度變化、pH調節、離子強度變化等等，但是大多數策略只能在離體緩沖溶液中使用，與體內環境不同，阻礙了其在生物醫學領域的應用。最近，酶促自組裝（EISA）策略成為在體內環境中進行原位自組裝的有效方法。目前EISA策略已被廣泛應用于癌細胞抑制、組織工程以及藥物輸送等領域。此外，自組裝的動力學和熱力學途徑對于自組裝肽的形貌和功能是至關重要的。酶催化在動力學上是可控的，它能夠提供更精確且可控的構建多肽類超分子材料的方法。

【成果簡介】

近日，南開大學的楊志謀教授（通訊作者）團隊報道了關于酶促自組裝（EISA）在肽制備具有生物功能的超分子納米材料和水凝膠方面的應用。本文中作者重點關注EISA的獨特性質，以制備其他常規方法無法獲得的超分子材料。首先，作者討論了用于活細胞中成像或治療的多肽原位EISA。接著，作者探討了在由EISA形成的超分子材料的性質中前體的重要性。同時，作者還介紹了通過EISA使多肽可控折疊和自組裝的策略。最后，作者強調通過與其它方法的結合，EISA可以以更精確的模式和時空控制制備超分子納米材料。本文著重強調了EISA對多肽自組裝的重要性，有助于進一步推動基于多肽的材料的臨床轉化。該綜述以題為“Enzyme-Instructed Self-Assembly (EISA) and Hydrogelation of Peptides”發布在國際著名期刊Adv. Mater.上。

【圖文解讀】

1、EISA原位形成超分子材料

在生理條件下，酶可以有效地催化形成和轉化許多生物學上重要的分子。因此，利用酶促進分子自組裝是一種有效且溫和的制備超分子材料的方法。此外，酶的表達水平與疾病也是密切相關。由于疾病部位如腫瘤中某些酶的過量表達，使得EISA可能發生在疾病部位或異常細胞內。所以，通過EISA原位形成超分子納米材料可以用于疾病的診斷和治療。

1.1、癌細胞中磷酸酶原位形成熒光納米纖維用于成像

圖一、利用腫瘤中過表達的磷酸酶原位形成納米纖維和水凝膠
A、通過磷酸酶催化的去磷酸化形成的前體及其相應的熒光水凝膠化合物的化學結構；

B、在細胞內成像酶觸發的超分子自組裝的成像原理；

C、熒光共聚焦顯微鏡圖像；

D、通過在PBS中混合100 μL每種稀釋的細胞分數和化合物1，每種樣品的光學圖像。

1.2、基質金屬蛋白酶（MMP）原位形成納米纖維抑制癌細胞

圖二、對腫瘤中過量表達的基質金屬蛋白酶-7 (MMP -7)的利用
A、MMP-7催化的自組裝和前體（ER-C16）及其相應的凝膠劑（G-C16）的化學結構；

B-E、用ER-C16（B, C）或G-C16（D, E）孵育18 h后，對HeLa細胞（B, D）和MvE細胞（C, E）的活/死率測定。

1.3、在線粒體中原位形成納米纖維以抑制癌細胞

圖三、接有抑制劑的靶向分子用于線粒體EISA
A、前體（L-1P和D-1P）及其相應的成膠分子（L-1和D-1）的化學結構，以及用于靶向線粒體和誘導癌細胞死亡的EISA機理；

B、用L-1P或D-1P（50×10^-6 M）處理4 h的Saos2細胞的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像，用Mito-定位染料染色。

2、前體參與EISA

EISA是一種比傳統方法更復雜的分子自組裝觸發方法。其成膠前體可能在超分子納米材料的形成中發揮重要作用。在EISA過程中，前體可以與生成的分子協同組裝，從而穩定并促進納米結構的形成。通過優化EISA過程的條件，包括酶濃度和溫度變化以及不同前體的使用，可以形成不同的超分子納米材料。例如，當使用磷酸化的前體和低濃度的酶時，疏水性肽只能通過EISA形成水凝膠。

2.1、利用EISA對疏水性肽進行凝膠化

圖四、生物環境中疏水化合物形成的超分子納米材料
A、前體4及其相應的成膠分子5的化學結構和前體的示意圖；

B、4 的 PBS緩沖液（pH 8.0）溶液；

C、在PBS緩沖液（pH 8.0）中對5超聲處理后；

D、通過向4的溶液中加入磷酸酶形成的懸浮液；

E、通過將磷酸酶加入到4的溶液中形成水凝膠I；

F、通過向4的溶液中加入磷酸酶形成的水凝膠II；

G, H、在pH為0和9.0的水溶液中的水凝膠II。

2.2、通過前體的預組裝縮小超分子組裝體的多樣性

圖五、具有不同磷酸化位點的前體的EISA過程
A、通過磷酸酶從pY₁、pY₂和pY₃轉化的前體pY₁、pY₂、pY₃和Nap-YYY的化學結構；

B、pY₁、pY₂和pY₃溶液的CD光譜；

C、pY₁、pY₂和pY₃溶液的激光照射圖像（有光路說明有自組裝體形成）；

D、三種前體的不同自組裝行為的示意圖。

2.3、酶控制肽組裝的構象

圖六、三種不同磷酸化位點的發夾形成肽的前體
A、PP1、PP2和PP3的化學結構和發夾肽的EISA過程的示意圖；

B、加入LPP后PP1的時間依賴性CD光譜；

C、沒有添加LPP的PP2的CD光譜；

D、不添加LPP的PP3的CD光譜。

3、通過EISA控制多肽折疊和組裝

眾所周知，多肽的構象對納米材料的形態和生物活性具有重要的影響。然而，目前控制多肽的折疊仍然具有挑戰性。盡管多肽超分子納米材料的形態具有多樣性，但其功能卻難以優化。利用EISA從前體中產生自組裝多肽，特別是在低溫條件下的前體多肽的構象更加均勻，因此產生的超分子納米材料能在更高的能量水平上被動力學捕獲，從而產生具有最佳生物活性的更有序的納米材料。同一多肽段在不同溫度下通過改變自組裝途徑，例如從加熱、冷卻到EISA，由于多肽段的構象不同，可能會自組裝成具有不同形貌的納米材料。因此，這是一種通過優化多肽的構象和超分子納米材料的理化性質而得到預期生物活性材料的簡單而有效的策略。

3.1、通過EISA形成α-螺旋

圖七、EISA在輔助肽折疊和促進納米藥物的形成的作用
A、6和7的化學結構以及通過加熱-冷卻過程形成的6的懸浮液和由磷酸酶在4 ℃催化的超分子水凝膠7的光學圖像；

B、CD光譜顯示通過EISA在4 ℃形成的納米纖維中肽的α-螺旋構象和通過加熱-冷卻過程形成的納米顆粒中肽的β-折疊構象；

C、CRB、納米纖維和納米顆粒對不同癌細胞的IC₅₀值；

D、CRB、納米纖維和針對4T1腫瘤模型的納米顆粒的體內抗癌效率。

3.2、EISA對肽折疊的動力學控制

圖八、EISA對肽折疊的動力學的影響
A、前體8和結構單元9的化學結構以及肽在不同溫度下的分子自組裝的模式；

B、在4 ℃下形成的水凝膠及其TEM圖像；

C、在37 ℃下形成的澄清溶液及其TEM圖像；

D、在4 ℃下形成的納米纖維和37 ℃下形成的納米顆粒的CD光譜；

E、在不同時間點對納米纖維和納米顆粒的細胞攝取。

4、EISA與其他方法的結合

雖然諸如腫瘤等疾病部位的某些酶的表達水平較高，但這些酶在正常組織或正常細胞中也有一定的表達水平。因此，在疾病部位選擇性形成超分子納米藥物的窗口范圍非常狹窄。通過兩種酶或其他方法與EISA結合，可以在病灶部位形成更有選擇性、更精確的超分子材料。

4.1、細胞環境分化的分子自組裝

圖九、細胞環境分化選擇性形成不同的納米藥物
A、10的化學結構和細胞外環境中EISA的示意圖和細胞內GSH控制的縮合；

B、水凝膠11和水凝膠中的納米纖維；

C、水凝膠11-D和水凝膠中的納米纖維。

4.2、肝癌細胞中的串聯分子自組裝

圖十、串聯分子自組裝策略對肝癌細胞的作用效果
A、前體12和相應的結構單元13和14的化學結構以及串聯自組裝的示意圖；

B, C、分別與12（200×10^-3 M）孵育0.5和2 h 的HepG2細胞的共聚焦激光掃描顯微鏡重合圖像（藍色熒光：細胞核；黃色熒光：NBD肽）；

D、化合物12, 13, 14和15被癌癥和正常肝細胞之間的細胞攝取比率；

E、化合物12, 13, 14和15對癌癥和正常肝細胞之間的細胞活力比率。

5、總結

綜上所述，在本文中作者著重強調了EISA在制備基于肽的納米材料和水凝膠方面的獨特優勢及其潛在的生物醫學應用價值。對比加熱冷卻、超聲、pH值等傳統制備肽基超分子納米材料的方法，EISA具有良好的應用前景，特別是某些材料只能通過EISA來提高性能。雖然現在已經證明了EISA在制備超分子納米材料中的重要性，但是目前在該領域仍舊存在許多挑戰。EISA原位制備納米材料基本都只是在癌細胞上進行的，還需要通過在其他疾病部位中具有升高的表達水平的酶的EISA來開發這些疾病的診斷或治療。由兩種酶構建或控制的超分子納米材料對靶細胞和器官具有更高的選擇性，因此需要理解酶輔助肽折疊和自組裝的機制以及制備具有所需特性的納米材料的基本原理。目前已經有許多其他的方法可以誘導多肽的自組裝，將它們與EISA相結合可以在更可控的模式下形成納米材料。然而，目前大多數研究都是在體外進行的，因此EISA在體內的應用研究還需要加強。總之，EISA是一種獨特的多肽自組裝控制策略，由它制備形成納米材料具有廣闊的應用前景。

文獻鏈接：Enzyme-Instructed Self-Assembly (EISA) and Hydrogelation of Peptides（Adv. Mater., 2019, DOI: 10.1002/adma.201805798）

本文由CQR編譯。

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