湖大譚蔚泓院士團隊JACS: 利用生物正交化學和前藥設計構筑新型癌癥化學動力治療新策略

【背景介紹】

通過研究發現，幾乎所有類型的細胞都會產生一類具有反應活性的物質—自由基，其是低水平下各種生物過程中必不可少的管理者。在近十年里，科研人員進行了大量的研究以探索自由基在癌癥等疾病發展中的作用。研究發現，癌細胞在整個生命周期中會產生過量的自由基（主要是過氧化氫（H₂O₂）），通過代謝重編程促進癌細胞的快速增殖、轉移等。然而，當自由基含量超過自由基水平的閾值時，會對細胞產生不可逆的氧化損傷并最終導致其死亡。因此，針對癌細胞中失控的氧化還原穩態發展起來的化學動力學療法（CDT）被廣泛研究，以期望對多種癌癥有更好的治療效果。

目前，雖然已開發了多種CDT策略用于癌癥治療，但是它們主要依靠經典的Fenton或Haber-Weiss反應，即利用過渡金屬將內源性低反應活性的H₂O₂轉化為羥基自由基（^.OH），進而殺死癌細胞。然而，這些過程存在兩個關鍵的限制因素：（1）高反應速率的Fenton和Haber-Weiss反應需要非常低的pH值（pH=2-4），而腫瘤微環境（TME）呈現弱酸性，難以滿足要求；（2）腫瘤中H₂O₂水平存在異質性，且隨著反應的消耗導致治療效果顯著降低。此外，癌細胞會產生大量的抗氧化劑，如谷胱甘肽（GSH），以抵抗自由基引起的應激損傷，對CDT療效的提高帶來了障礙。因此，為獲得良好的治療效果同時降低毒副作用，理想的化學動力制劑應滿足以下特征：（a）在腫瘤處靶向富集，而對正常氧化還原信號不會產生明顯的影響；（b）溫和的、空間可控的化學反應過程，從而定向釋放高活性的自由基；（c）減少反應過程對腫瘤內源性活性物質的依賴性；（d）能同時消耗腫瘤內抗氧化劑；（e）具有良好的生物相容性、生物可降解性和質量控制。

【成果簡介】

近日，湖南大學譚蔚泓院士和劉艷嵐教授所在團隊首次報道了通過結合生物正交化學和前藥設計兩個概念，創建了一種新型核酸適體-藥物偶聯物（ApDC）：核酸適體-前體藥物偶聯物（ApPdC）膠束，能夠特異性識別癌細胞和并通過自循環放大的方式在癌細胞內原位產生有毒自由基。ApPdC膠束包含以下三個部分：識別癌細胞的核酸適體、Fe2+可激活的四惡烷（T）的自由基前藥堿基，以及能夠響應TME并提供Fe²⁺用于原位激活T的血紅素。首先，不同于傳統的膠束，作者設計的前藥中包含的疏水性前藥堿基不僅可以觸發核酸適體自組裝成剛性的多組分膠束結構，而且還可以通過生物正交反應形成大量的自由基，從而顯著提高藥物堿基的負載量并降低毒副作用。

其次，ApPdC膠束在生理條件下處于靜默狀態，但通過受體介導的癌細胞內化后會引發級聯的生物正交反應。負載的血紅素（Fe³⁺）被細胞內GSH還原成血紅素（Fe²⁺），從而觸發T活化，進而產生基于C的有毒自由基，而這一過程不依賴于腫瘤酸度或H₂O₂的含量。此外，血紅素能夠消耗癌細胞內GSH，進一步降低了癌細胞的抗氧化能力，從而發揮協同治療作用。同時，產生的血紅素（Fe²⁺）會導致癌細胞中Fe²⁺離子含量的升高，進一步活化ApPdC膠束中的前藥堿基，通過自循環的方式促進毒性C基自由基的累積。此外，ApPdC可通過亞磷酸酰胺化學在DNA合成儀上自動合成，因此可以精準地控制前藥堿基的偶聯位點和數量，具有優良的質量控制性能，有利于未來的臨床轉化。總之，該生物正交化學和前藥設計的組合策略可以擴展到其它核酸適體，從而構建出一系列ApDC用于各種癌癥的靶向治療。同時，該工作也為自由基相關的分子機制奠定了重要基礎。研究成果以題為“Molecular Self-Assembly of Bioorthogonal Aptamer-Prodrug Conjugate Micelles for Hydrogen Peroxide and pH-Independent Cancer Chemodynamic Therapy”發布在著名期刊J. Am. Chem. Soc.上。

【圖文解讀】

圖一、基于生物正交的ApPdC膠束用于癌細胞自循環和原位擴增有毒自由基的示意圖

圖二、ApPdC的合成與分子組裝及其表征
（A）“T”合成的示意圖；

（B）（1）游離AS1411、（2）Ap-6G-“T”和（3）Ap-6G-H-“T”的凝膠電泳分析；

（C-D）Ap-6G-“T”和Ap-6G-H-“T”的DLS分析、AFM成像和Zeta電位。

圖三、游離核酸適體和不同ApPdC膠束在血清和核酸酶中的穩定性
（A-B）瓊脂糖凝膠分析游離核酸適體和不同ApPdC膠束在FBS中的降解速率；

（C-D）瓊脂糖凝膠分析游離核酸適體和不同ApPdC膠束在核酸酶中的降解速率。

圖四、激活機制
（A-B）游離Fe²⁺或血紅素（Fe²⁺）介導的前藥堿基“T”的激活機制；

（C-D）利用DEPMPO作為自由基捕獲劑，在游離Fe²⁺或由連二亞硫酸鹽還原產生的血紅素（Fe²⁺）活化下，由“T”產生的自由基的ESR測量。

圖五、癌細胞識別和原位產生有毒自由基
（A）細胞流式儀分析不同的ApPdC和非靶向膠束在HepG2細胞中的結合能力；

（B）共聚焦熒光成像分析ApPdC和非靶向膠束在HepG2細胞中的結合能力；

（C）游離核酸適體和ApPdC膠束的溶酶體共定位。

圖六、測定不同處理后HepG2細胞中的自由基水平
（A）細胞流式儀分析不同處理后HepG2細胞中的自由基水平；

（B）共聚焦熒光成像顯示不同處理后HepG2細胞中的自由基水平。

圖七、對癌細胞毒性的協同作用
（A-B）用Ap-6G-“T”，Ap-6G-H-“T”和相應的非靶向膠束處理的HepG2細胞的細胞存活率；

（C）鈣黃綠素-AM和碘化丙啶（PI）雙染色方法分析Ap-6G-“T”，Ap-6G-H-“T”或相應的非靶向膠束處理的HepG2細胞的活性；

（D-E）用Ap-6G-2“T”、Ap-6G-H-2“T”或相應的非靶向膠束處理后HepG2細胞的細胞存活率。

【小結】

綜上所述，作者成功地合成了一種新的靶向抗癌藥物，該藥物通過結合前藥和生物正交化學來靶向調節氧化還原穩態失調的癌細胞，用于癌癥靶向化學動力學治療。通過全面的機制研究，以提高對ApPdC膠束的癌細胞特異性激活和治療活性的基本認識。研究發現，ApPdC膠束中的前藥堿基可被細胞內Fe²⁺激活，從而引發級聯的生物正交反應，原位產生以毒性碳自由基。此外，強疏水性前藥堿基允許血紅素被負載在ApPdC膠束中。這種產生自由基的過程不依賴于強酸性pH或內源性H₂O₂，并且同時通過消耗GSH削弱癌細胞的抗氧化能力。以AS1411為代表，作者系統評估了ApPdC膠束對癌細胞自由基特異性調節的潛力。盡管ApPdC膠束在細胞水平顯示了良好的治療效果，后續工作仍需要進一步研究其在體內的藥代動力學和ApPdC膠束的抗癌效果，以更好地說明它們在癌癥治療方面的潛力。此外，ApPdC膠束對正常細胞或組織的長期安全性問題也需要進一步探索。總之，該研究為開發新型有效的ApPdCs、特異性治療多種晚期癌癥奠定了基礎。

文獻鏈接：Molecular Self-Assembly of Bioorthogonal Aptamer-Prodrug Conjugate Micelles for Hydrogen Peroxide and pH-Independent Cancer Chemodynamic Therapy（JACS, 2019, DOI: 0.1021/jacs.9b10755）

通訊作者簡介

譚蔚泓，美國密西根大學物理化學博士，中國科學院物理化學碩士，湖南師范大學化學學士。現任中國科學院腫瘤與基礎醫學研究所所長，中國科學院大學附屬腫瘤醫院教授。兼任上海交通大學分子醫學研究院院長，湖南大學化學化工學院、生物學院教授。譚蔚泓教授的主要研究方向是生物分析化學、化學生物學和分子醫學。他在國際國內知名學術刊物上發表學術論文650余篇，H-index 138，引用近64,500多次。2014-2019連續六年入選湯森路透全球高被引研究人員名單。研究成果獲2018年美國化學會“光譜化學分析獎”，2018年何梁何利基金科學與技術獎，2019年匹茲堡分析化學成就獎，2019年生物分析化學杰出貢獻獎。2005年當選美國AAAS Fellow，2015年當選中國科學院院士，2016年當選發展中國家科學院院士。

劉艷嵐，化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，湖南大學化學化工學院教授，分子科學與生物醫學實驗室，博士生導師，國家千人計劃“青年項目”入選者。主要從事多功能探針的設計合成及在重大疾病的活體成像及分子靶向干預研究。相關工作以第一作者及通訊作者身份發表在J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Chem. Rev.、PNAS、Adv. Mater.等國際權威期刊上。文章總他引次數5000多次。多篇文章入選“ESI高被引文章”。

團隊網頁：http://tanhnugroup.com/Home

本文由CQR編譯。

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