浸會大學&清華大學Science Advances: 晶體缺陷效應提高包埋酶的表觀催化活性
引言
高催化活性和良好穩定性是酶催化劑在藥物合成、醫療診斷、生物醫藥等很多領域應用的關鍵。將酶分子包埋于無機晶體中，利用載體微環境的限域效應可以顯著提高酶催化劑在人工應用環境下的穩定性，是基于化學工程和納米技術手段改造酶催化劑的高效途徑。但是，常規無機晶體酶固定化材料（例如金屬有機骨架晶體）具有很小的孔徑結構，導致酶催化反應過程中底物擴散受限，難以與包埋于晶體中的酶分子高效接觸，從而降低了酶催化劑的表觀活性；而降低底物擴散阻力的嘗試，又往往在合成步驟傷害酶的活性或損失酶固定化的牢固程度，使得活性和穩定性難以兼得。如何改造酶固定化材料的結構使其提高酶穩定性的同時保持高活性成為一大挑戰。微流控科技為解決這一難題提供了新思路和獨特手段。
成果簡介
1月29日，香港浸會大學任康寧團隊和清華大學戈鈞團隊合作在Science Advances發表文章Defect-induced Activity Enhancement of Enzyme-Embedded Metal-Organic Frameworks Revealed in Microfluidic Gradient Mixing Synthesis，報道了基于微通道混合制備具有高催化活性的酶-金屬有機骨架晶體復合物的新方法。該研究發現，在微通道中，基于層流狀態下形成的濃度梯度混合方式合成的復合物顆粒具有顯著的配位缺陷，從而產生大量介孔，有利于底物和包埋酶的傳質接觸，大幅提高了固定化酶催化劑的表觀活性，同時保持了固定化酶良好的穩定性和可重復使用的優點。
該研究發現，不同于溶液中一步共沉淀合成酶-金屬有機骨架晶體復合物的過程，在微通道中，層流狀態下反應物分子自由擴散形成的濃度梯度使得每個酶-金屬有機骨架晶體復合物顆粒在形成過程中經歷了顯著的濃度擾動，導致大量的配位缺陷而形成介孔結構（見Figure 1）。
研究中通過掃描電鏡、透射電鏡、X射線衍射、X射線吸收精細結構譜、BET孔徑分析、反應-擴散模型模擬計算等手段相結合，對比了微流控層流合成與常規溶液中一步共沉淀法合成酶-金屬有機骨架晶體復合物的結構差異。反應-擴散模型模擬計算結果顯示在微通道中的層流擴散混合方式會形成濃度梯度，導致每個載體顆粒在形成過程中經歷隨時間不斷變化的配體-金屬離子濃度比（Figure 3A, B）。X射線衍射發現此條件下形成的復合物也具有接近常規溶液中一步共沉淀法合成的酶-金屬有機骨架晶體復合物的衍射峰，但存在結晶度低及峰位偏移現象，說明可能形成了含缺陷的晶體; 氮氣吸附實驗確認了復合物中存在直徑3-6 nm的介孔，而相應的傳統晶態復合物中僅存在1 nm左右的微孔；X射線吸收精細結構譜說明相比于晶態金屬有機骨架復合物，層流擴散中合成的載體材料中存在配位缺陷。這些分析表征證明了載體中由于鋅離子的配位缺失導致了材料中介孔結構的出現。通過載體中的酶催化反應-擴散模型的理論計算，該研究發現晶態復合物中1 nm左右的微孔限制了酶的底物分子在載體中的傳質，從而嚴重降低了酶催化劑的表觀活性，而微流控層流合成的酶-金屬有機骨架復合物中，大量3-6 nm的介孔有利于底物分子的傳質。在活性對比測試中，微流控層流合成的酶催化劑的表觀活性比傳統溶液法合成提高5~20倍，接近于天然狀態酶的活性（Figure 3C）。對照實驗也證明單純選擇層流梯度混合濃度變化范圍內的某個濃度進行常規一步共沉淀法合成并不能提高活性。同時，微流控層流合成的載體與傳統晶態載體相似，通過限域包埋顯著提高了酶催化劑在高溫、蛋白酶等苛刻條件下的穩定性。因為微流控層流合成形成介孔的過程是自發的，并不需要借助模版和置換溶劑等過程，包埋反應溫和不傷害酶活性，從而成為兼得活性和穩定性的創新思路。
圖文導讀
圖 1 ?基于微流體通道內層流梯度混合產生的晶體缺陷效應提高酶催化劑表觀活性示意圖。
（A）在微通道中，由于反應物濃度梯度變化產生配位缺陷，生成含有介孔的酶-MOF復合物
（B）在常規溶液反應下形成的酶-MOF復合物為微孔結構。
圖 2微通道中基于層流的濃度梯度混合方式合成酶-MOF復合物表征。
（A-C）微通道中三種混合方式合成酶-MOFs復合物明場圖
（D）微流控芯片合成的負載細胞色素酶C的MOFs掃描電鏡圖
（E）微流控芯片合成的負載細胞色素酶C的MOFs透射電鏡-能量色散X射線元素譜圖
（F）常規溶液反應下合成的酶-MOF復合物掃描電鏡圖
（G）純MOFs和負載細胞色素酶C的MOFs熱重分析曲線
（H）微流控芯片和常規溶液下合成的酶-MOF復合物及純MOFsX射線粉末衍射圖譜
圖 3 微通道中基于層流的濃度梯度混合方式合成酶-MOFs復合物機理考查
（A）微通道中基于層流的濃度梯度混合方式產生連續變化的2-甲基咪唑和鋅離子摩爾比
（B）三種混合方式下反應物在通道中的模擬圖
（C）不同2-甲基咪唑和鋅離子摩爾比下合成的GOx-MOFs相對活性
圖 4 基于微流控合成酶-MOFs復合物的結構表征和活性考查
（A）基于微流控和常規溶液合成的GOx-MOFs延伸X光吸收細微結構曲線
（B）不同2-甲基咪唑和鋅離子摩爾比合成的GOx-MOFs密度泛函理論計算的孔隙分布曲線
（C-D）天然酶、基于微流控和常規溶液反應合成的酶-MOFs復合物相對活性
（E）胰蛋白酶水解后的相對活性
（F）不同溫度下天然酶和酶-MOFs復合物的相對活性
總結
該研究工作創新性的將微流體的獨特物理特性應用到酶固定化合成反應，觀察到了顯著不同于常規方法的產物特性，通過系統研究證實在此反應條件下產物自發包含介孔結構，并深入分析了其產生機理及對酶催化劑表觀活性的影響。該研究表明這種梯度動態混合模式有望成為一種重要的固定化酶合成新方法，通過自動產生介孔的溫和反應過程在保證穩定性的同時，極大提高了酶催化劑的活性，解決了當前工程化改造酶催化劑研究中難以兼顧活性和穩定性的難題，為酶催化劑工程改造提供了新思路。同時，利用微流控梯度動態混合引發產物晶體結構缺陷，可能為精確改造納米結構/材料提供了新理論基礎，有望作為一種通用方法合成具有新特性的納米材料。該工作同時也拓展了微流控技術在納米材料、生物化學等領域的應用。
胡沖博士（香港浸會大學、江西科技師范大學）和白云岫（清華大學）為本文共同第一作者，香港浸會大學助理教授任康寧，清華大學化工系長聘副教授戈鈞為本文共同通訊作者。戈鈞團隊長期致力于酶催化劑工程基礎和應用研究，任康寧團隊長期致力于微流控和微納科技的研究與應用。該研究得到國家重點研發計劃納米科技重點專項青年項目、國家自然科學基金優秀青年基金、北京市自然科學基金杰出青年基金等項目的資助。
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