Adv. Mater.報道：仿煙草花葉病毒的策略用于治療多藥耐藥癌癥

【背景介紹】

在過去的幾十年里，奇妙的自然界不斷啟發科學家對于生物體結構和功能的仿生。病毒（virus）是由核酸分子（DNA或RNA）與蛋白質構成的非細胞形態，靠寄生生活的介于生命體及非生命體之間的有機物種，可以感染幾乎所有具有細胞結構的生命體。作為一種自然界中高度進化的納米尺度的有機體，由于其高侵染性，被廣泛用作藥物和基因的載體。但是其毒性、變異性和免疫原性往往限制了生物安全性，已有報道一些不良病毒載體的案例。因此，開發高效、安全的人工病毒在生物醫用材料研究領域中得到了越來越廣泛的關注。人工病毒在生物醫學應用中模仿（甚至超過）其原病毒的性能和效果。長期以來，狂犬病病毒、煙草花葉病毒等具有獨特棒狀形貌的病毒被用于藥物遞送、基因轉染和腫瘤成像，因為它們具有的高長徑比形態有利于長循環、腫瘤靶向、腫瘤滲透和細胞攝取。其中，TMV是一種典型的棒狀病毒，是生物醫學中最常用的病毒。在感染期間，TMV病毒粒子進入宿主細胞并在內質網（ER）中積累，從而導致ER形態發生巨大變化。同時TMV還能滲透到毗鄰細胞中進行二次侵染。因此，構建結構/功能高度仿TMV的納米粒子，通過合理的設計充分發揮其形貌優勢，優化協調多機制抗腫瘤的策略非常具有研究前景。

目前，具有屏蔽、靶向、抗腫瘤功能的新一代溶瘤病毒，能夠特異性感染和裂解惡性腫瘤細胞。通過保護病毒不被網狀內皮系統（RES）過早消除，選擇性的靶向癌癥組織，并對病毒武裝以前藥、基因和細胞因子等“武器”，能顯著提高抗癌效果。然而，多功能化可能導致各種功能相互間的交叉抗性。此外，病毒通過實體瘤傳播仍然存在挑戰，因為高的腫瘤選擇性意味著避免非癌性細胞侵染，這往往限制病毒在整個腫瘤中擴散。因此，具有優異的溶瘤和細胞間擴散能力的人工病毒在抗癌方面很具潛力。

【成果簡介】

近日，四川大學的顧忠偉教授團隊報道了一種新策略，并利用該策略來構建了一種與棒狀煙草花葉病毒（TMV）結構極為相似的人工煙草花葉病毒（ATMVs）。其中，ATMVs的設計巧妙地采用了屏蔽、靶向等方法，使其具有避免病毒被過早消除、選擇性地靶向腫瘤組織和溶瘤能力的優點。這些負電荷的棒狀顆粒在血液中隱匿長循環，直到其到達腫瘤深處部位，持續產生強大的復合溶瘤過程，包括：細胞膜滲透、內質網破壞以釋放Ca²⁺、化療遞送和光熱療法。更重要的是，ATMVs不僅裂解初次侵染的細胞，而且滲透到相鄰細胞中進行二次侵染，使細胞間擴散，甚至在實體瘤深處繼續誘導裂解。該工作激發了具有獨特形狀的優化溶瘤功能的病毒樣納米粒子，該仿病毒粒子完全擊敗了大型耐藥結腸癌（LoVo/Adr，約500 mm³）。研究成果以題為“Bioinspired Artifcial Tobacco Mosaic Virus with Combined Oncolytic Properties to Completely Destroy Multidrug-Resistant Cancer”發布在國際著名期刊 Adv. Mater.上。四川大學顧忠偉教授和南京工業大學徐翔暉教授為共同通訊作者，第一作者為四川大學2017級博士生吳花雨。

【圖文解讀】

圖一、ATMVs用于治療多藥耐藥性癌癥的示意圖
（A）ATMVs的制備示意圖；

（B）細胞間和腫瘤內部的溶瘤示意圖。

圖二、ATMVs的納米結構和釋放效果
（A）SWNT-Rs、SSAPs和ATMVs溶液的紫外可見吸收光譜和熒光光譜；

（B）SWNT-Rs和ATMVs的TEM圖像以及ATMVs的AFM圖像；

（C）ATMVs的CD光譜；

（D）ATMVs溶液在808 nm（2.0 W cm^-2，7 min）激光照射下的光熱曲線，以及線性時間數據相對于冷卻過程的-ln(θ)（τ_s=342.25 s）；

（E）當pH從生理條件（pH=7.4）變為酸性（pH=6.5）時，ATMVs的表面電荷反轉；

（F）當暴露于酸（pH=6.5，pH=5.0）和近紅外輻射（2.0 W cm^-2）時，DOX釋放。

圖三、ATMVs的體外侵染過程
（A）各種對照組材料處理2 h后，利用熒光強度和拉曼光譜對cellar吸收進行定量；

（B）在有無近紅外輻射下，用ATMVs處理2 h后，LoVo/Adr細胞的LDH泄漏和SEM圖像；

（C）LoVo/Adr細胞的TEM圖像顯示，ATMVs處理24 h后，ATMVs粘附并破壞了細胞膜以及嚴重的ER粗糙擴展；

（D）LoVo/Adr細胞與ATMVs和SSAPs孵育0.5、6h后的2PLSM圖像；

（E）在與SSAPs、ATMVs和ATMVs一起在NIR照射下孵育24 h后，LoVo/Adr的CLSM圖像；

（F）用ATMVs和SSAPs預處理的細胞的熒光圖像1 h，然后在有無NIR照射的情況下孵育0、1、3、6、9和12 h。

（G）用DOX·HCl、ATMVs和ATMVs在激光照射下處理24 h的LoVo/Adr細胞的CLSM圖像；

（H）在用各種制劑處理48 h后，使用Annexin V/7AAD檢測分析和流式細胞術分析LoVo/Adr細胞的凋亡。

圖四、ATMVs的滲透效果
（A）分別與DOX·HCl、SSAP和ATMVs孵育1 h的預處理細胞擴散至鄰近細胞的測試示意圖；

（B）流式細胞儀測試了在A孔和B孔共培養12 h后DOX陽性細胞的速率，以及在A孔和B孔共培養48 h之后的活/死細胞的速率；

（C）由ATMVs誘導的二次侵染示意圖；

（D）在用SSAPs和ATMVs（有無NIR照射）處理6 h后的3D LoVo/Adr MTS的2PLSM圖像；

（E）注射各種制劑24 h后，冷凍切片的免疫熒光染色用于DOX、SWNT、DAPI和CD31標記的血管的腫瘤內分布；

（F）注射后24 h后，腫瘤10 μm厚的石蠟切片的偽彩色拉曼圖；

（G）在靜脈內注射各種制劑24 h后的定量結果，來自小鼠的腫瘤組織的光聲圖像的疊加。

圖五、ATMVs的體內代謝、累積和抗腫瘤效果
（A）以靜脈注射后的DOX和SWNT-R支架為特征的藥代動力學曲線；

（B）靜脈內注射各種制劑（以DOX含量為特征）后，在不同組織中的生物分布；

（C）靜脈注射后，LoVo/Adr荷瘤裸鼠的熒光圖像；

（D-E）在NIR輻射下，用紅外熱成像圖像測量用ATMVs、RSAPs和SWNT-Rs治療的小鼠中腫瘤組織的溫度升高曲線和溫度升高對腫瘤組織的暴露時間曲線；

（F）靜脈注射生理鹽水、DOX·HCl、SSAPs、RSAPs和ATMVs后，LoVo/Adr荷瘤裸鼠的腫瘤體積和存活率；

（G）肝轉移的圖片和肝組織的H＆E染色分析。

【小結】

? ? ? ?綜上所述，作者報道了一種制備仿病毒的新策略，該策略高度模仿了天然TMV的細長結構和某種近似的生物行為，被稱為人工煙草花葉病毒。設計了循環時間長、靶向腫瘤組織性強、溶瘤潛能強的ATMVs。獨特的高光譜形態優化了溶解腫瘤功效，可以通過膜破壞、ER擾動、Ca2+釋放、光熱和化學療法共同實現有效裂解。該藥物不僅能裂解原發感染的細胞，而且還能滲透到鄰近的細胞中進行二次侵染，從而使細胞間擴散并深入穿透實體瘤。此外，由于其突出的結構穩定性，ATMVs的完整性在持續感染的環境中可保持較長時間，表現出壓倒性的深部溶瘤作用，以完全擊敗大型耐藥結腸腫瘤。總之，該工作為新型病毒樣策略提供了廣泛的可能性，通過優化了獨特的形態學特征以應對復雜的癌癥環境，并最終殺死多藥耐藥癌癥。

文獻鏈接：Bioinspired Artificial Tobacco Mosaic Virus with Combined Oncolytic Properties to Completely Destroy Multidrug-Resistant Cancer.（Adv. Mater., 2020, DOI: 10.1002/adma.201904958）

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