【NS精讀】遠離Bad Blood式騙局——如何實現“滴血驗癌”？

引言

還記得幾年前鬧得沸沸揚揚的“Bad Blood”騙局嗎？一家名為Theranos宣稱只需一點點血液樣本就能檢測多達數十種疾病，未來甚至能有望高效檢測血液中的癌癥標志物。然而，隨著數據的不斷披露，人們漸漸發現這種檢測方式非常不可靠，取血量遠遠不能滿足檢測限需求，隨后原本前景無限的Theranos公司遭遇資本危機，如今已黯然遠離人們的視野。然而，“滴血驗癌”真的無法實現嗎？血糖儀是一款非常經典的疾病檢測器件，只需一點指尖血，就能測量人體血糖水平。但是對于像癌癥這類重大疾病來說，單一的檢測指標很難作為判斷依據，因此多重酶檢預覽 （在新窗口中打開）測（multiplexed enzymatic detection）必不可少。

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然而，由于酶的最優活性條件各不相同，多重檢測的實現一直是一個艱巨的科學任務。雖然近年來，基于生物大分子親和能力的電化學生物傳感器在多重酶檢測已取得許多研究進展，但是其商業化前景依然不明。最主要的原因是電化學生物傳感是基于由電極、樣品等組成的閉環電學電路，樣品中的生物標記物組分（大多為非檢測相關蛋白質）會與電極進行非特異性結合并污染電極，從而減弱電流和靈敏度。而傳統的防污涂層，如牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇（PEG）自組裝單層雖然可以防止電極污染，但也會阻礙電子輸運，使得防污策略陷入兩難的境地。因此，開發可靠的防污策略是電化學生物傳感器繼續發展所亟需解決的挑戰。近期，哈佛大學著名的仿生工程學家Donald E. Ingber（通訊作者）等人通過改造電極可以有效防止蛋白質污染，在長達一個月的血液檢測中仍然可以維持傳感器優異檢測性能。該篇研究文章題為“An antifouling coating that enables affinity-based?electrochemical biosensing in complex biological?fluids”，于2019年11月11日發表于Nature Nanotechnology。

哈佛團隊在Nature Nanotechnology發表的關于生物傳感器的最新文章?

防污電極制備

首先，讓我們來看看在這項工作新型防污電極是如何制備的。如圖1a-1c所示，研究人員設計了一種由BSA和導電納米材料（金納米線、金納米顆粒或者碳納米管）交錯而成的三維納米復合材料。通過混合以及超聲-離心作用來均化納米復合材料，再利用滴涂法（drop-casting）將納米復合材料滴涂到金電極芯片表面形成防污涂層。由此制得的電極在電化學活性的三鐵氰化鉀（potassium ferriferrocyanide）溶液進行循環伏安法檢測。其中，還原峰和氧化峰之間的電位差值ΔEp和電流密度可以評價電極表面和溶液之間的電子輸運動力學，從而反映傳感器固液界面的狀態和質量。如圖1d-1e所示， BSA和BSA/金納米線涂層都會鈍化電極，而BSA/金納米顆粒和BSA/碳納米管涂層則能分別保留25%和75%的電流密度，表明納米顆粒可以有效介導電子輸運。當電極與含1%的BSA緩沖液一起孵育（1-d，一天）以測試電極防污性能時，除了BSA/碳納米管涂層電極外所有電極的電化學性能都經歷了衰退；其中，BSA/金納米顆粒涂層電極表現出寬達0.4V的電位差值，說明由于生物污染造成溶液中鐵氰根離子至電極表面的擴散受到限制。為了解決這一擴散限制問題，研究人員將戊二醛添加到納米復合材料中用以交聯BSA分子，從而形成布滿導電納米材料的多孔三維蛋白質基質。在BSA/金納米顆粒/戊二醛涂層中依然出現明顯的電極鈍化，研究人員認為金納米顆粒能夠堵塞基質孔。然而，在其他電極中，交聯了戊二醛之后的電化學性能都能得到明顯的提升。特別是，BSA/金納米線/戊二醛涂層電極能夠觀察到具有與裸金電極相似的電化學行為（圖1f-1g）。

圖1?納米復合涂層及其電化學表征

為了深入理解這些電極的電化學增強機理，研究人員利用掃描電子顯微學（SEM）對涂層的多孔性進行了表征（圖2）。SEM圖片顯示，在納米復合材料形成過程中，BSA與用于穩定金納米線的離子表面活性劑進行疏水及靜電相互作用，從而在金納米線附近發生BSA吸附行為。；當BSA與戊二醛進行交聯時，這一吸附行為則會在納米線周圍沉積產生多孔類海綿蛋白質基質。由此，研究人員認為BSA/金納米線/戊二醛涂層中的孔道結構具有納米電極作用，電活性物種就能實現穿膜輸運或者孔擴散行為。相比之下，由于金納米顆粒的粒徑大于孔徑，在交聯過程中金納米顆粒不會與BSA基質整合，反倒會堵塞孔道。因此，BSA/金納米顆粒/戊二醛涂層中的孔結構更小更少，當納米復合材料厚度增加時，電子和電活性物種輸運變得更加困難。

圖2?BSA/金納米線/戊二醛納米復合材料的表征

防污機制

這一孔道結構不僅能夠提高電極的電化學性能，還能賦予BSA/金納米線/戊二醛涂層防污效果。在交聯的BSA基質中，孔道能夠篩選排斥尺寸較大的粒子，限制這些粒子的擴散行為，從而封堵它們通往電極表面的路徑。一方面，戊二醛能夠在具有伯氨的條件下快速反應形成在交聯過程中充當結構膠角色的吡啶聚合物。在該項工作中，至少需要5個戊二醛分子形成吡啶聚合物，由此才能在BSA的氨基間形成有效的聚合物交聯，并進一步在兩個BSA分子間形成連接（linkage）。納米復合材料中每個BSA的連接數（2、1、甚至更少）決定了產物分別是線性BSA聚合物、BSA二聚體抑或是BSA單體。因此當連接數相似與（甚至高于）活性氨基酸時，能夠產生交聯度更高的BSA聚合物，同時在這些聚合物表面也會出現過量未反應的戊二醛分子甚至是吡啶聚合物。這些在涂層表面的吡啶聚合物則可以與污染蛋白（fouling proteins）反應，從而堵塞孔道，削弱涂層的防污能力。如圖3所示，增加戊二醛的原料比可以顯著增加BSA線性聚合物的產量，從而才能形成高度交聯的三維基質網絡。而另一方面，研究認為蛋白質上連接數的分布呈現離散概率分布。當戊二醛的含量提高時，每個BSA上連接數不僅更高，其概率分布也更廣（例如1BSA/1戊二醛的涂層中80%的BSA具有16-28個連接）。這樣的結果不僅導致涂層更加異質化，更會壓縮孔徑，導致電流密度降低和電位差值變大。最后，通過比較測量，研究優選出的BSA/金納米線/戊二醛涂層（5 mg/mlBSA，1%戊二醛以及≥50 μg/ml金納米線），其與1%的BSA緩沖液孵育一天后具有最高的電流密度、最小的電位差值以及最低的性能下降程度。

圖3?BSA與戊二醛的交聯能夠影響電極性能

血漿分析

對于臨床診斷來說，生物傳感器在復雜生物體液中的性能表現是最為重要的評價指標。因此，研究人員將上述優選出的含有BSA/金納米線/戊二醛涂層的電化學傳感器分別與1%的BSA緩沖液、未處理的人血清以及人血漿進行孵育。比較發現，BSA/金納米線/戊二醛涂層傳感器在一個月后依然只有約7%的靈敏度損失，其電流密度與裸金電極相差無幾，表現出優異的防污性能（圖4a）。在電化學酶夾心檢測試驗中，電極先后與靶向特異性抗體、目標檢測蛋白白介素（IL-6）、偶聯有辣根過氧化物酶（HRP）的抗IL-6檢測抗體進行孵育（圖5），當四甲基聯苯胺（TMB）加入時，HRP氧化TMB并在電極涂層表面產生可以被伏安法檢測到的電活性產物。如圖4b所示，與PEG-SAM涂層電極相比，BSA/金納米線/戊二醛涂覆的電極能夠表現出優異的伏安曲線，表明BSA/金納米線/戊二醛涂層電極能夠輕易檢測到IL-6。更深入的檢測表明，BSA/金納米線/戊二醛涂層電極在未處理人血漿中的IL-6檢測限可以達到23pg/ml，而PEG-SAM涂層電極則無法在血漿中檢測出信號值（圖4c）。最后，檢測后的電極能夠利用甘氨酸鹽酸鹽進行清洗并儲存，經過一周/一月的儲存后電流密度的損失率非常小，依然能實現有效的IL-6檢測（圖4d）。

圖4?涂層防污與生物檢測性能

圖5?納米復合電極實現體液IL-6檢測示意圖（圖片來源：Nat. Nanotech. 2019, 1089-1090.）

結論

雖然近年來電極的防污研究進展不少，但是這篇文章提出的電極制備方法卻異常簡單，只需將復合混合物進行滴涂即可。涂層基質中的BSA骨架能夠阻止非特異性蛋白吸附，同時允許可溶性的電活性物種能夠最大限度地擴散到電極周圍。最終，金電極在涂覆BSA/金納米線/戊二醛納米復合涂層后電流密度可以保留88%以上，在儲存期長達一個月左右的條件下信號損失值只有10%左右，證明這一防污策略是切實高效的。

參考文獻：An antifouling coating that enables affinity-based?electrochemical biosensing in complex biological?fluids

文獻鏈接：https://www.nature.com/articles/s41565-019-0566-z

本文由nanoCJ供稿。

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