東南大學劉必成和呂林莉Sci. Adv.：細胞外囊泡包裹IL-10作為缺血性AKI的新型納米療法

【引言】

急性腎損傷（AKI）是由多種因素引起的腎功能快速下降的危急重癥，在住院患者中具有高發病率、高死亡率等特點。此外，AKI幸存者進展為慢性腎臟病（CKD）和終末期腎病的風險顯著增高。但是，目前尚無明確的療法來治療AKI或阻止其發展為CKD。白介素10（IL-10）是一種功能強大的免疫調節劑，具有強大的抗炎和組織再生能力。在AKI中，研究表明IL-10可以通過限制炎癥細胞因子的產生和免疫細胞浸潤來預防缺血，順鉑或輸尿管梗阻引起的腎損傷，這表明IL-10可能成為AKI的新型療法。然而，細胞因子易受化學和物理因素影響而不穩定，并且不可避免地激活循環中的白細胞，這可能導致患者傷害或降低治療效果。解決該問題的關鍵是提高IL-10的穩定性并選擇性地靶向受損的腎臟。細胞外囊泡（EVs），例如外泌體和微囊泡，是細胞以組成型或誘導型方式分泌的小膜顆粒（大小為40至1000 nm）。釋放的細胞外囊泡通過將核酸和蛋白質轉運至遠端或附近的細胞而自然地充當細胞間的信使。最近的研究表明，細胞外囊泡作為強大的納米載體進行藥物輸送在化學治療、基因治療等領域展現出巨大的應用前景。與現有的遞送系統相比，細胞外囊泡的獨特優勢是其天然來源，這使其能夠逃避吞噬作用，延長藥物循環半衰期并降低免疫原性。因此，基于EV的藥物遞送系統可能是推動IL-10用于AKI治療的新型給藥策略。

【成果簡介】

東南大學劉必成和呂林莉報道了一種從巨噬細胞衍生的負載IL-10的細胞外囊泡（IL-10+EV）的有效制備方法，并研究了IL-10+細胞外囊泡在缺血性AKI鼠模型中的治療效果。IL-10+EV能夠增強IL-10的穩定性，并有效地靶向損傷的腎臟，這是由于其表面富含粘附成分包括整聯蛋白α₄β₁，α₅β₁，α_Lβ₂和α_Mβ₂。IL-10+EV的治療不僅可靶向腎小管間質中的巨噬細胞，而且可靶向腎中的腎小管上皮細胞（TECs），可顯著改善腎臟缺血/再灌注（I/R）損傷，并防止AKI向CKD的轉變。具體而言，文章顯示IL-10 + EV抑制了哺乳動物雷帕霉素（mTOR）的靶標，因此促進了線粒體代謝以維持TEC中的線粒體穩態。同時，IL-10 + EV還可誘導巨噬細胞向M2型轉化，促進腎臟修復。這個發現強烈支持將細胞外囊泡用作IL-10的多功能遞送系統，將其作為治療缺血性AKI的有效策略。該成果以題為“Extracellular vesicle–encapsulated IL-10 as novel nanotherapeutics against ischemic AKI”發表在Sci. Adv.上。

【圖文導讀】

圖1.IL-10+細胞外囊泡的制備和表征

（A）用RFP標記的IL-10轉染RAW細胞，然后用地塞米松刺激

（B）在工程RAW細胞中對IL-10（綠色）和EV標記CD63（紅色）進行免疫染色

（C）在IL-10+細胞外囊泡中對EV相關的（Alix，CD63和CD81）和巨噬細胞相關的標志物（CD68和CD206）進行蛋白質印跡分析

（D）IL-10+細胞外囊泡的尺寸分布和代表性TEM圖像

（E）顯示從抗體陣列分析獲得的每種細胞因子的蛋白質水平

（F）細胞外囊泡中IL-10的ELISA分析，以及IL-10+細胞外囊泡中的IL-10和IL-10受體的蛋白質印跡分析（n = 3或6）

（G）通過實時定量PCR測量IL-10+細胞外囊泡中的IL-10 mRNA

（H-1）比較IL-10 +細胞外囊泡和游離IL-10在不同條件下的穩定性，包括在37°C或-80°C下放置一周，在pH 5.5溶液中12小時

圖2.腎靶向IL-10+EV

（A）以親代RAW細胞為對照的IL-10+EVs蛋白質組成的LC-MS/MS分析

（B）蛋白質印跡分析

（C-E）為了分析體內分布，給小鼠靜脈注射DID標記的IL-10+EV（n=3）

（C）注射后6、12、24、48和96小時（缺血時間35分鐘）對指定器官的熒光強度成像

（D）缺血20分鐘，28分鐘和35分鐘的IRI腎臟在12小時時的熒光強度成像

（E）代表性共聚焦圖像顯示DID標記的IL-10+EV在小管（包括近端小管和遠端小管），內皮細胞（CD31）和巨噬細胞（CD68）中的蓄積

（F-G）H/R誘導的TECs攝取PKH67標記的IL-10+EV（n = 3）

圖3.IL-10+EV可預防小鼠的腎臟I/R損傷

（A）實驗設計示意圖

（B）IL-10+EV對血清肌酐的影響（n = 10）

（C）基于H＆E染色的腎小管損傷的量化（n = 10）

（D）腎皮質和髓質的H＆E染色的代表性圖像

（E-G）TUNEL染色和凋亡細胞定量的代表性圖像（n = 6）

（F-H）代表性共聚焦圖像和KIM-1+小管的定量（n = 6）

（I）腎臟組織中caspase-3的蛋白質印跡分析（n = 3）

（J）實時定量PCR分析腎臟組織中炎性細胞因子mRNA水平（n = 6）

圖4.IL-10+EVs抑制mTOR信號傳導并誘導線粒體保持線粒體穩態

（A）腎組織中mTOR信號和LC3的蛋白質印跡分析（n = 3）

（B）腎小管自噬事件的代表性TEM圖像

（C-E）評估IL-10 + EV對培養的TEC中線粒體功能的影響（n = 3）

（F）腎小管中線粒體的代表性TEM圖像

（G）腎臟切片中細胞色素C氧化酶亞基I（MT-CO1）表達的免疫組織化學分析

（H）線粒體呼吸鏈復合體I的酶活性（n = 6）

圖5.IL-10+EVs引起腎巨噬細胞表型轉變

（AB）分別用LPS，IL-4+IL-13或不同劑量的IL-10+EV刺激BMDM 48小時（ n = 3）

（C-E）IRI組與IL-10+EV組之間腎巨噬細胞表型變化的探討

圖6.IL-10+EV抑制AKI-CKD轉變

（A）PAS染色的代表性圖像（n = 6）

（B）矢狀面Masson三色染色的代表性圖像（n = 6）

（C）腎組織中膠原蛋白I和α-平滑肌肌動蛋白（β-SMA）的蛋白質印跡分析（n = 4）

（D）腎臟切片中CD68⁺巨噬細胞和CD3⁺T細胞的代表性共聚焦圖像（n = 6）

（E）用于治療缺血性AKI的IL-10+EV制劑的示意圖

【小結】

細胞外囊泡（EVs）用作天然藥物遞送系統已引起強烈的研究興趣。作者報告了一種通過工程巨噬細胞來制造負載白介素10（IL-10）的細胞外囊泡（IL-10+EV）的方法，用于治療缺血性急性腎損傷（AKI）。細胞外囊泡輸送不僅增強了IL-10的穩定性，而且還提高了其對腎臟的靶向性。IL-10+EV的治療可顯著改善由缺血/再灌注損傷引起的腎小管損傷和炎癥，并有效地防止了向慢性腎臟病的轉變。從機制上講，IL-10+EV靶向腎小管上皮細胞，并抑制了雷帕霉素信號傳導的哺乳動物靶標，從而促進線粒體自噬，維持線粒體穩態。此外，IL-10+EV可以通過靶向腎小管間質中的巨噬細胞有效地驅動M2巨噬細胞極化。研究表明，細胞外囊泡作為載體遞送IL-10的新型納米療法在AKI治療中具有廣闊的應用前景。

文獻鏈接：Extracellular vesicle–encapsulated IL-10 as novel nanotherapeutics against ischemic AKI. Sci. Adv., 2020, DOI: 10.1126/sciadv.aaz0748

本文由tt供稿編輯。

劉必成，東南大學醫學院院長，江蘇省腎臟病臨床研究中心主任，東南大學腎臟病研究所所長，東南大學首席教授(二級)、主任醫師，博士（后）研究生導師，兼任中華醫學會腎臟病學會副主任委員，中國腎臟生理學會副主任委員等。近年來，劉必成教授團隊主要致力于細胞外囊泡在腎臟疾病中的基礎與應用研究，取得了一系列具有國際影響力的原創性成果：（1）發現了細胞外囊泡介導的細胞間通訊在腎小管間質炎癥形成中的重要作用 [1-4]；（2）開展了基于細胞外囊泡的腎臟新型靶向治療研究 [5-8]。課題組先后開發了利用巨噬細胞源細胞外囊泡遞送地塞米松和白介素-10的新型納米療法用于腎臟炎癥的治療。同時還報道了利用中空纖維系統大規模制備間充質干細胞源外泌體的新方法。相關工作已申請國內國際專利3項，目前授權1項，相關轉化及推廣正在進行中。

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