Adv. Mater. 報道：納米疫苗！生物體內合成的、自組裝蛋白納米顆粒來助力

【背景介紹】

在過去的十多年里，納米技術在疫苗學中得到了廣泛應用，由此研制的納米疫苗在乙肝、流感、艾滋病毒及腫瘤等傳染病和重大疾病的預防和治療中展現出了廣闊的應用前景。相比于純抗原疫苗，納米疫苗的優勢主要包括：（1）納米載體可避免抗原被快速降解，提高了疫苗制劑的穩定性；（2）提供良好的佐劑性能，促進抗原提呈細胞的激活；（3）納米尺寸增強了抗原在淋巴結的富集，進一步提升其免疫應答能力。近年來，許多新型無機和有機納米顆粒（NPs）（如金納米顆粒、硅基納米顆粒、脂蛋白納米盤和納米凝膠等）在納米疫苗的開發中取得了令人矚目的成果。然而這些納米疫苗制備技術都需使用化學合成方法，或者需要進一步將合成方法與基于細胞的半生物合成步驟相結合，制備工藝較為繁瑣，抗原的活性無法有效保證。利用工程化的細菌或哺乳動物細胞只需一步即可實現蛋白質的合成，由此開發的如病毒樣顆粒、鐵蛋白等生物合成的蛋白納米疫苗不僅具有生產時間短、成本低等優點，還具有更高的生物相容性和安全性。然而，該策略仍然面臨抗原裝載率低，難以偶聯具有復雜結構的多糖抗原等技術難點。

【成果簡介】

近日，北京生物技術研究所的王恒樑研究員和朱力副研究員、中科院過程工程研究所的馬光輝研究員和魏煒研究員（共同通訊作者）等人報道了一種Nano-B5平臺，用于生物體內一步合成完全基于蛋白質的、自組裝的、穩定的納米疫苗。該平臺由細菌AB₅毒素（能夠與細胞表面受體神經節苷脂結合）和非天然三聚體肽融合表達后自組裝而成，采用蛋白融合或糖基化修飾策略，可以在普通大腸桿菌菌株和減毒病原菌株中生產負載多肽、多糖等不同類型抗原的納米疫苗。特別值得注意的是，這些納米疫苗不僅具有高效的抗原負載能力，其蛋白骨架本身還具有免疫刺激劑作用，能夠快速激活抗原提呈細胞，強化免疫應答水平。在小鼠和猴子等多種動物模型中，該納米疫苗都展示出了優異的淋巴結靶向能力、高效的免疫應答水平以及良好的生物安全性，證明了其在傳染病預防以及腫瘤治療中的積極作用。此外，Nano-B5平臺可以實現蛋白骨架與抗原貨物的模塊化組裝，可用于新型疫苗的按需快速構建。研究成果以題為“Biosynthesis of Self-Assembled Proteinaceous Nanoparticles for Vaccination”發布在國際著名期刊Adv. Mater.上。

【圖文解讀】

圖一、設計用于體內生產模塊化和自組裝的納米疫苗
（a）納米疫苗的模塊化設計方案及其多樣化的應用配置；

（b）體內表達負載不同類型抗原的納米疫苗的示意圖；

（c）在免疫接種后，納米疫苗迅速引流至淋巴結并激活APC，誘導產生高效的體液和細胞免疫反應。

圖二、各種自組裝蛋白質納米顆粒的制備和表征
（a）對照細胞和表達納米顆粒的細胞的TEM圖像，免疫熒光法檢測表達蛋白；

（b）純化的納米顆粒的TEM圖像，以及納米顆粒單體的SDS-PAGE分析；

（c）納米顆粒溶液的丁達爾效應及其在室溫下放置48 h前后的粒徑分布；

（d）對單體自組裝成多面體顆粒的模型結構進行分子動力學模擬；

（e-f）用AB₅毒素的其它B亞單位（LTB和StxB）替換CTB，通過考馬斯亮藍染色和免疫印跡分析單體以及通過DLS對顆粒進行表征。

圖三、偶聯不同抗原的納米疫苗的表征
（a）糖基化NPs的TEM和SEM圖像及其粒徑分布；

（b）通過考馬斯亮藍染色和免疫印跡檢測糖蛋白；

（c）串聯質譜（MS/MS）分析糖基化NP的OPS部分；

（d）檢測納米顆粒對GM1的結合親和力；

（e）通過體內糖基化將甲型副傷寒沙門氏菌多糖結合至NP底盤，及該多糖疫苗的表征；

（f）NP C-端融合OVA的SIINFEKL肽段后的表征。

圖四、納米疫苗增強淋巴結的靶向并引發高效的免疫激活
（a-b）不同時間點，不同疫苗在注射部位和引流淋巴結（dLNs）中的熒光成像圖片和相應的定量熒光分析；

（c）疫苗接種24 h后，dLNs內DCs的MHC分子和共刺激分子的表達；

（d）DCs在體外培養，經不同的刺激處理后，免疫相關指標的轉錄水平變化；

（e）體外DCs經NP-OPS刺激后，轉錄組測序并對免疫相關途徑的KEGG富集分析；

（f）轉錄組測序結果中不同細胞因子的表達情況；

（g）接種3天后，dLNs中CD8⁺T細胞的比例以及CD8⁺T細胞中表達顆粒酶B （GrB）的細胞比例；

（h）接種3天后，dLNs細胞中CD4⁺T細胞的比例以及接種7天后dLNs中濾泡T細胞（Tfh）和生發中心B細胞的比例。

圖五、納米疫苗誘導針對細菌感染的強力預防作用
（a）評估納米疫苗預防性能的免疫流程圖；

（b）用PBS、OPS、OPS+Al（氫氧化鋁）、C-OPS、NP-OPS免疫的BALB/c小鼠后檢測血清中抗福氏志賀氏菌2a型301株的LPS的IgG亞型效價；

（c）（b）中血清經不同稀釋度處理后的血清殺菌活性；

（d）在末次免疫兩周后，利用301野生株對小鼠進行腹腔攻毒（每只小鼠約4.35×10⁷ CFU感染量），觀察小鼠存活情況；

（e）通過腹膜內注射熒光素酶標記的福氏志賀氏菌2a型301株觀察免疫小鼠的體內殺菌活性。

圖六、負載OVA SL8肽的納米疫苗通過誘導強烈的細胞免疫應答來抑制腫瘤生長
（a）評估納米疫苗腫瘤治療效果的流程圖；

（b）不同治療組中小鼠的生長曲線；

（c）（b）中各組小鼠的存活時間；

（d）腫瘤組織的凋亡和增殖的免疫熒光切片；

（e）23天時各組小鼠的腫瘤重量；

（f）腫瘤組織中浸潤的CD8⁺T細胞的免疫熒光切片；

（g）腫瘤中CD8⁺T細胞的比例；

（h）腫瘤組織中浸潤的CD8⁺T細胞中分泌顆粒酶B和IFN-γ的細胞百分比。

圖七、在食蟹猴中評估納米疫苗的性能
（a）在食蟹猴中評估治療方案的示意圖；

（b）納米疫苗遞送至引流淋巴結（dLNs）；

（c）在不同疫苗免疫后，dLNs的大小變化；

（d）針對甲型副傷寒沙門氏菌CMCC 50973株的LPS的IgG效價評價；

（e）抗體誘導的針對甲型副傷寒沙門氏菌的血清殺菌作用；

（f）血液中CD8⁺T細胞中顆粒酶B的表達；

（g）細胞毒性T細胞對感染細胞的裂解能力；

（h-i）納米疫苗的安全性評價。

【小結】

綜上所述，該工作表明此納米疫苗在靈長類動物和小鼠中均具有很高的安全性，并且在高效激發機體免疫應答方面優于常規疫苗。作為一項創新技術，納米疫苗中的多糖抗原是由細菌自身合成，可確保其天然構象并保持抗原的保真度，有利于激發特異性免疫反應。將來，研究人員將進一步測試該納米疫苗對難以用抗生素治療的多重耐藥細菌和胞內細菌的預防能力。同時，作者證實了大分子量多糖鏈（超過30 kDa）與納米顆粒的成功連接，為更長的肽段甚至蛋白質結構域在納米平臺表面的展示提供了理論基礎。針對SARS-CoV-2對公共健康的威脅，作者認為該Nano-B5底盤也可以通過展示S蛋白的受體結合結構域，用作快速開發有效的抗病毒納米疫苗的工具。另一方面，基于Nano-B5的模塊化設計，有助于淋巴結靶向的多抗原納米疫苗的研制。此外，考慮到這些模塊設計最終被編碼為穩定的DNA，因而可適用于潛在的多種不同細胞宿主，并進行分析、測試和應用，，而這些底盤本身也可以通過工程設計以支持多種功能化修飾，從而提高特異性和改善疫苗性能。

文獻鏈接：Biosynthesis of Self-Assembled Proteinaceous Nanoparticles for Vaccination.（Adv. Mater., 2020, DOI:10.1002/adma.202002940）

通訊作者簡介

中科院過程工程研究所馬光輝研究員和魏煒研究員團隊自2006年起對先進疫苗遞送系統進行了率先探索和深入研究，發現和創制了一系列疫苗新劑型，解決了抗原免疫原性差、生物利用度低等難題，在腫瘤、乙肝、流感等重大疾病和傳染病的預防和治療上取得顯著療效，部分劑型已通過倫理批準進入臨床前和臨床研究，相關工作相繼發表于Nat. Mater., 2018, 17, 187、Nat. Commun., 2017, 8, 14537、Sci. Adv., 2020, 6, eaay7735、Adv. Mater., 2018, 31, 1801067、Adv. Sci., 2017, 4, 1700083、ACS Cent. Sci., 2019, 5, 796、Small, 2018, 14, 1704272、Biomaterials, 2015, 41, 1等期刊上。

北京生物技術研究所王恒樑研究員和朱力副研究員團隊長期致力于細菌多糖結合疫苗的生物合成研究，采用具有自主知識產權的細菌蛋白O-糖基化系統成功合成了針對志賀氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、布氏桿菌等新型疫苗，革新了傳統的細菌多糖結合疫苗制備方法，相關工作相繼發表于ACS Appl. Mater. Interfaces, 2019, 11, 44933、mBio., 2016, 7, e00443-16、npj Vaccines, 2018, 3, 4、Microorganisms, 2020, 8, 436等期刊上，授權國內專利2項。

本文由CQR編譯。

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