清北聯合Nature Commun.：新型功能化石墨烯改善冷凍電鏡優勢取向

一、【導讀】

2017年諾貝爾化學獎授予Jacques Dubochet, Joachim Frank 和Richard Henderson，以表彰他們對“冷凍電鏡技術”領域的貢獻，該獎被戲稱為“一個發給了物理學家的諾貝爾化學獎，獎勵他們幫助了生物學家”。早在20世紀70年代科學家們就利用冷凍電鏡（Cryo-EM）研究病毒分子的結構，首次提出了冷凍電鏡技術的原理、方法以及流程的概念。單顆粒Cryo-EM三維重構技術是目前用于解析生物大分子高分辨率結構的主流手段之一。然而，高質量的Cryo-EM樣品制備仍然面臨很多挑戰，如氣液界面、優勢取向和背景噪音等，極大地限制了結構解析效率。

二、【成果掠影】

近日，清華大學王宏偉教授、饒燏教授、劉楠博士和北京大學彭海琳教授等人合作在知名期刊Nature Communications上以題為“Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM”報告通過重氮鹽分子對CVD生長的石墨烯膜進行功能化修飾開發了具有不同電荷性質基團的功能化石墨烯支撐膜，用于Cryo-EM樣品制備。與聚合物轉移法相比，石墨烯支撐膜以石蠟作為轉移介質可以潔凈地轉移到電鏡載網上，其污染更少。通過應用于三種不同類型的生物大分子，證明了高產率功能化石墨烯電鏡載網可使大分子遠離氣液界面（AWI），并實現了可調節的粒子取向分布，以實現更穩健的單顆粒冷凍電鏡結構測定。研究表明，這種功能化石墨烯支撐膜提供了一種較為友好的作用界面，有助于保護生物大分子的三維結構。清華大學生命科學學院博士生陸葉、博士后劉楠，藥學院博士生劉永波以及北京大學化學與分子工程學院博士畢業生鄭黎明為本文共同第一作者。

三、【核心創新點】

開發了具有不同電荷基團的功能化石墨烯支撐膜，用于Cryo-EM樣品制備，可使生物大分子遠離AWI，并實現了可調節的粒子取向分布，以實現更穩健的單顆粒冷凍電鏡結構測定。

四、【論文掠影】

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圖1、石蠟輔助石墨烯在EM支撐膜上轉移 ?2022 Hongwei Wang

（a）石蠟輔助的石墨烯轉移到EM支撐膜上的示意圖。

（b）石蠟轉移的石墨烯支撐膜的高倍率TEM圖像。

（c）高倍率的AFM圖像。

圖二、功能化石墨烯支撐膜的表征 ?2022 Hongwei Wang

（a）用于冷凍電鏡分析的功能化石墨烯的示意圖。

（b）懸浮功能化石墨烯膜的代表性TEM顯微照片。

（c）石墨烯（紅色）和功能化石墨烯（藍色）的拉曼光譜。

（d）石墨烯（紅色）和官能化石墨烯（藍色）的積分布拉格反射相對強度。

（e）NFG和SFG的X射線光電子光譜。

（f）石墨烯、NFG和SFG的水接觸角（WAC）。

圖三、不同電性修飾的石墨烯用于Cryo-EM分析 ?2022 Hongwei Wang

（a）cryo-ET重建揭示了20S蛋白酶體在NFG膜上的分布。

（b）從NFG支撐的樣品的低溫層析圖中提取的石墨烯表面剖面。

（c）20S蛋白酶體在NFG上的歐拉角分布。

（d）cryo-ET重建顯示20S蛋白酶體在SFG膜上的分布。

（e）從SFG支撐的樣品的低溫層析圖中提取的石墨烯表面剖面。

（f）20S蛋白酶體在SFG上的歐拉角分布。

（g）50S核糖體在NFG上的歐拉角分布。

（h）50S核糖體在NFG上的首選視圖。

（i）50S核糖體在SFG上的歐拉角分布。

（j）50S核糖體在SFG上的首選視圖。

圖四、具有不同電荷的石墨烯解決L1 LtrB RNP的優先取向問題?2022 Hongwei Wang

（a-d）L1.LtrB RNP復合物在NFG和SFG上的顆粒取向分布。

（e）使用NFG和SFG的組合顆粒重建的L1.LtrB RNP復合物的三維重構密度圖。

（f）L1.LtrB RNP的DV密度與相應的模型對接（PDB: 8H2H）。

五、【前景展望】

綜上所述，研究人員開發了一種有效的清潔轉移策略，使用石蠟作為轉移媒介來制造帶電的石墨烯膜，然后通過重氮鹽分子對CVD生長的石墨烯膜進行功能化修飾。帶電的石墨烯支撐膜根據目標分子的表面電荷特性，為蛋白質分子或大分子復合物提供了不同性質的表面，以便與之相互作用。因此能夠調控取向分布，避免了AWI帶來的負面影響，成功解決了優勢取向問題。

文獻鏈接：Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM (Nat. Commun., 2022, 13, 6718)